ESSEN. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Kürzlich wurde gezeigt, dass der Ascomycetenpilz Ilyonectria crassa Kartoffelknollen infizieren kann. Diese Arbeit ist die erste, die die biologischen Eigenschaften und die Resistenz einiger aus Kartoffeln isolierter Fungizide des I. crassa-Stammes analysiert. Die Sequenzen der artspezifischen Regionen des „Kartoffel“ -Stamms stimmten mit denen überein, die zuvor für Pilze erhalten wurden, die aus den Wurzeln von Narzissen, Ginseng, Espe und Buche, Lilienknollen und Tulpenblättern isoliert wurden. Anscheinend können viele Wild- und Gartenpflanzen Reserven von I. crassa sein. Der untersuchte Stamm infizierte Tomaten- und Kartoffelscheiben, infizierte jedoch nicht die gesamte Tomatenfrucht und die intakte Kartoffelknolle. Dies zeigt, dass I. crassa ein Wundparasit ist. Die Bewertung der Resistenz gegen Fludioxonil, Difenoconazol und Azoxystrobin auf einem Nährmedium zeigte eine hohe Wirksamkeit dieser Arzneimittel.
Der EC50-Indikator (die Konzentration des Fungizids, die sich gegenüber der Nicht-Fungizid-Kontrolle um das Zweifache der radialen Wachstumsrate der Kolonie verlangsamt) betrug 2; 0.4 bzw. 7.4 mg / l. Die Möglichkeit der Entwicklung der durch I. crassa verursachten Krankheit sollte bei der phytopathologischen Beurteilung von Kartoffelknollen und der Entwicklung von Pflanzenschutzmaßnahmen berücksichtigt werden.
Die Entwicklung phytopathogener Mikroorganismen führt in allen Stadien des Kartoffelanbaus und der Lagerung zu hohen Verlusten. Bei der Planung von Schutzmaßnahmen werden in der Regel bekannte Krankheitserreger wie Arten der Gattungen Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora usw. berücksichtigt. In den letzten Jahren sind jedoch immer mehr Berichte über das Auftreten neuer phytopathogener Mikroorganismen auf Kartoffeln erschienen. Ihre Biologie ist schlecht erforscht, die Wirksamkeit von Fungiziden, die in Bezug auf Kartoffeln verwendet werden, ist unbekannt, diagnostische Methoden wurden nicht entwickelt. Mit der Massenentwicklung können sie die Kartoffelernte erheblich schädigen. Einer dieser Mikroorganismen ist der Ascomycetenpilz Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, der erstmals von den Autoren an Kartoffelknollen entdeckt wurde (Chudinova et al., 2019).
Diese Arbeit präsentiert die Ergebnisse der Analyse des aus Kartoffelknollen isolierten I. crassa-Stammes. Die Morphologie von Kolonien und Myzelstrukturen von I. crassa, Nukleotidsequenzen speziesspezifischer DNA-Regionen, Virulenz gegenüber Kartoffeln und Tomaten und Resistenz gegen einige beliebte Fungizide wurden untersucht.
Materialen und Methoden
Wir verwendeten den I. crassa 18KSuPT2-Stamm, der 2018 aus der infizierten Kartoffelknolle isoliert wurde, die in der Region Kostroma gezüchtet wurde. Die Knolle war von einer Trockenfäule mit einem mit hellbraunem Myzel bedeckten Hohlraum betroffen. Unter Verwendung einer sterilen Präpariernadel wurde das Pilzmyzel in eine Petrischale mit einem Agarmedium (Bierwürze 10%, Agar 1.5%, Penicillin 1000 U / ml) überführt. Die Platten wurden im Dunkeln bei 24 ° C inkubiert.
Ein Leica DM2500-Lichtmikroskop mit einer ICC50 HD-Digitalkamera und ein Leica M80-Binokularmikroskop mit einer IC80HD-Digitalkamera (Leica Microsystems, Deutschland) wurden verwendet, um die Größe und Morphologie von Sporen und Sporenorganen zu fotografieren, zu bewerten.
Zur Isolierung der DNA wurde das Pilzmyzel in flüssigem Erbsenmedium gezüchtet, dann in flüssigem Stickstoff eingefroren, homogenisiert, in CTAB-Puffer inkubiert, mit Chloroform gereinigt und zweimal mit 2% igem Alkohol gewaschen.
Das DNA-Extraktionsverfahren ist in dem Artikel von Kutuzova et al. (2017).
Um die Spezies durch molekulare Methoden zu bestimmen und mit anderen bekannten I. crassa-Stämmen zu vergleichen, wurde eine PCR mit Primern durchgeführt, die die Amplifikation speziesspezifischer DNA-Regionen ermöglichten: ITS1-5,8S-ITS2 (Primer ITS5 / ITS4, White et al., 1990), Genregionen b -Tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) und Translations-Elongationsfaktor 1α (tef1α) (Primer EF1-728F / EF1-986R, Carbone und Kohn, 1999). Amplikons der gewünschten Länge wurden unter Verwendung des Evrogen CleanUp-Kits aus dem Gel extrahiert. Die amplifizierten Regionen wurden unter Verwendung des BigDye® Terminator v3.1-Zyklussequenzierungskits (Applied Biosystems, CA, USA) auf einem automatisierten Sequenzierer 3730 xl von Applied Biosystems (Applied Biosystems, CA, USA) sequenziert. Die erhaltenen Nukleotidsequenzen wurden verwendet, um nach einer Übereinstimmung in der GenBank-Datenbank des US National Center for Biotechnology Information (NCBI) zu suchen. Die phylogenetische Analyse wurde unter Verwendung des MEGA 6-Programms durchgeführt (Tamura et al., 2013).
Die Bestimmung der Virulenz wurde an ganzen grünen Früchten von großfruchtigen Tomaten (Sorte Dubrava) und Kartoffelknollen (Sorte Gala) durchgeführt. Um Schäden an beschädigten Früchten und Knollen zu simulieren, haben wir außerdem Scheiben derselben Früchte und Knollen verwendet. Knollenscheiben wurden in feuchte Kammern gegeben, bei denen es sich um Petrischalen mit feuchtem Filterpapier am Boden handelte. Auf das Papier wurde ein Objektträger gelegt, auf den wiederum Knollen- oder Fruchtscheiben gelegt wurden. Ganze Knollen und Früchte wurden ebenfalls in Behälter mit feuchtem Filterpapier am Boden gegeben. In die Mitte der Scheibe (oder auf die intakte Oberfläche der Knolle oder Frucht) wurde nach 5 Tagen Wachstum auf Würze-Agar ein Stück Agar (5 × 5 mm) mit Pilzhyphen gelegt.
Die Bewertung der Resistenz von Pilzstämmen gegen Fungizide wurde unter Laborbedingungen auf Agar-Nährmedium durchgeführt. Wir untersuchten die Empfindlichkeit gegenüber Fungiziden Maxim, KS (Wirkstoff Fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (Azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (Difenoconazol 250 g / l) (Staatskatalog ..., 2020). Die Bewertung wurde in Petrischalen auf Würze-Agar-Medium unter Zugabe der untersuchten Arzneimittel in Konzentrationen des Wirkstoffs 0.1 durchgeführt; einer; 1 ppm (mg / l) (für Fludioxonil und Difenoconazol), 10; zehn; 1 ppm (für Azoxystrobin) und in Medien ohne Fungizid (Kontrolle). Das Fungizid wurde zu dem geschmolzenen Medium gegeben und auf 10ºC abgekühlt, wonach das Medium in Petrischalen gegossen wurde. Ein Agarblock mit Pilzmyzel wurde in die Mitte einer Petrischale gegeben und bei einer Temperatur von 100ºC im Dunkeln kultiviert. Nach 60 Tagen Inkubation wurden die Durchmesser der Kolonien in zwei zueinander senkrechten Richtungen gemessen; Die Messergebnisse für jede Kolonie wurden gemittelt. Die Experimente wurden dreifach durchgeführt. Basierend auf den Ergebnissen der Analysen wurde der EC24 berechnet, der der Konzentration des Fungizids entspricht, wodurch die Geschwindigkeit des radialen Wachstums der Kolonie im Vergleich zur fungiziden Kontrolle halbiert wurde.
Ergebnisse und Diskussion
Auf Petrischalen mit Würze-Agar bildete der Pilz Kolonien mit weißem flockigem Myzel. Das Medium unter dem Myzel wurde rotbraun. Wenn das Medium austrocknet, bildet der Pilz bei kleinen und aggregierten Conidiophoren bei kleinen Sporodochien Sporen zweier Arten. Makrokonidien sind länglich, zylindrisch, mit ein bis drei Septen, einer durchschnittlichen Länge von 27.2 um mit einem Wertebereich von 23.2 bis 32.2 um, einer Breite von bis zu 4.9 um (Fig. 1). Die durchschnittliche Länge von Mikrokonidien beträgt 14.3 um mit einem Wertebereich von 10.3 bis 18.1 um, die Breite beträgt bis zu 4.0 um. Alle makro- und mikromorphologischen Merkmale passen in den Variationsbereich der Art Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Die Sequenzen speziesspezifischer DNA-Regionen (ITS, b-Tubulin, TEF 1 & agr;) stimmten vollständig mit den Sequenzen der zuvor untersuchten I. crassa-Stämme überein (Chudinova et al., 2019, Tabelle 1). Um die Prävalenz von I. crassa in anderen Regionen zu untersuchen und das Spektrum der betroffenen Kulturen zu analysieren, wurden analoge DNA-Sequenzen in der GenBank-Datenbank analysiert (Tabelle 1). Die Überlappung betrug 86 bis 100%. Die Sequenzen aller drei DNA-Regionen des I. crassa-Stammes „Kartoffel“ waren identisch mit den Sequenzen der Stämme, die aus den Lilienknollen- und Narzissenwurzeln in den Niederlanden und aus der Ginsengwurzel in Kanada isoliert wurden. Wir konnten keine anderen I. crassa-Stämme mit drei analysierten ähnlichen Sequenzen in offenen Datenbanken finden. Die Analyse der abgelagerten ITS- und b-Tubulin-Sequenzen zeigte jedoch das Vorhandensein von I. crassa auf Tulpenblättern in Großbritannien. Pilze mit einer ähnlichen ITS-Sequenz wurden bei der Analyse der Mykobiota von Espenwurzeln in Kanada und Buchenwurzeln in Italien sowie Kartoffelknollen in Saudi-Arabien identifiziert (Tabelle 1). Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass I. crassa weltweit verbreitet ist und verschiedene Pflanzenarten infizieren kann.
Bei der Bestimmung der Pathogenität an Tomaten- und Kartoffelscheiben am 5. Tag erreichte der Durchmesser der Läsion 1.5 cm. Der untersuchte Stamm infizierte nicht die gesamte Tomatenfrucht und die intakte Kartoffelknolle. Die Kelchblätter waren jedoch an der Tomate betroffen. Um die Möglichkeit einer Kontamination auszuschließen, wurde ein Pilzisolat aus dem auf einer Kartoffelknollenscheibe entwickelten Myzel in eine Reinkultur isoliert. Es war völlig identisch mit dem elterlichen Stamm. Anscheinend ist I. crassa ein Wundparasit.
Die Behandlung von Samenknollen vor dem Pflanzen mit Fungiziden verringert die Entwicklung von Pflanzenkrankheiten während der Vegetationsperiode. Für die Auswahl wirksamer Fungizide ist es wichtig zu beurteilen, welche von ihnen gegen I. сrassa wirksam sind. Die Arbeit untersuchte weit verbreitete Wirkstoffe von Fungiziden - Fludioxonil, Azoxystrobin, Difenoconazol. Fludioxonil ist in mehreren Mischungen enthalten, die zum Anrichten von Samen und Samenknollen vor dem Pflanzen verwendet werden. Fludioxonil (Maxim) wird auch zur Behandlung von Samenknollen vor deren Lagerung verwendet. Difenoconazol und Azoxystrobin sind auch in einer Reihe von Zubereitungen zur Verarbeitung von Saatgut sowie in Zubereitungen zur Verarbeitung vegetativer Pflanzen enthalten (Staatskatalog ..., 2020).
Die Wachstumsrate von I. crassa wurde an Medien (Fig. 2) mit unterschiedlichen Wirkstoffkonzentrationen untersucht: Fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), Azoxystrobin (EC50 = 4 ppm) und Difenoconazol (EC50 = 7.4 ppm) (Tabelle 2). Diese Präparate können als hochwirksam gegen I. crassa angesehen werden, da ihre EC50 signifikant niedriger ist als die empfohlene Konzentration des Präparats in der zur Behandlung von Knollen verwendeten Arbeitsflüssigkeit. Nach dem Staatskatalog ... (2020) beträgt die Konzentration von Fludioxonil in der Flüssigkeit zur Behandlung von Kartoffelknollen 500 bis 1000 ppm, Azoxystrobin (in der Flüssigkeit zur Behandlung des Furchenbodens) - 3750-9375 ppm, Difenoconazol (in der Flüssigkeit zur Behandlung vegetativer Pflanzen) - 187.5– 625 ppm.
Tabelle 1. Ähnlichkeit von Sequenzen speziesspezifischer Sequenzen des Stammes 18KSuPT2 und der Stämme von Ilyonectria crassa, die in der Genbank-Datenbank verfügbar sind
Belastung | Wirtspflanze, Ausscheidungsort | Bei der GenBank hinterlegte Sequenznummern, Prozentsatz der Ähnlichkeiten | Link | ||
SEINE | β-Tubulin | TEF1α | |||
17KSPT1 und 18KSuPT2 | Kartoffelknolle, Region Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, diese Arbeit |
CBS 158/31 | Narzissenwurzeln, Niederlande | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Lily Birne, Niederlande | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Ginsengwurzel, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Tulpenblatt, Großbritannien | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Espenwurzeln, Kanada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Buche, Italien | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Direkte Einreichung |
KAUF19 | Kartoffelknolle, Saudi-Arabien | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = nicht hinterlegt
Tabelle 2. Resistenz von Ilyonectria crassa gegen Fungizide
(aktive Substanz) | EC50, ppm | ||||
3 Tag | 5 Tag | 7 Tag | |||
Steuern | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (Fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (Difenoconazol) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
In unserer Arbeit wurden I. crassa-Stämme aus Kartoffelknollen in den Regionen Kostroma und Moskau (Chudinova et al., 2019) isoliert. Bei der Analyse der Mykobiota von Kartoffelknollen in Saudi-Arabien wurde ein hoher Anteil an Pilzstämmen mit ITS-Sequenzen festgestellt, die mit I. crassa identisch sind (Gashgari und Gherbawy, 2013). Anscheinend ist I. crassa auf Kartoffeln nicht so selten, wie es scheint. Unsere Experimente zeigten, dass der Pilz beschädigte Tomatenfrüchte infizieren kann. Aus der Literatur ist bekannt, dass I. crassa in der Lage ist, sich saprotroph im Boden zu entwickeln (Moll et al., 2016) und eine Vielzahl von Pflanzen zu beeinflussen, auch taxonomisch entfernte Pflanzen wie Narzissen, Lilien, Ginseng, Espe und Buche (Tabelle 1). einer). Anscheinend können viele Wild- und Gartenpflanzen Reserven von I. crassa sein. Das Obige zeigt, dass bei der Entwicklung von Schutzmaßnahmen die Möglichkeit einer Beeinflussung von Kartoffelknollen mit diesem Pilz berücksichtigt werden muss. Weit verbreitete Präparate zur Behandlung von Kartoffelknollen, die Fludioxonil, Azoxystrobin und Difenoconazol enthalten, haben eine hohe fungizide Wirksamkeit gegen I. crassa gezeigt.
Diese Arbeit wurde von der Russischen Stiftung für Grundlagenforschung (Grant Nr. 20-016-00139) unterstützt.
Der Artikel wurde in der Zeitschrift "Plant Protection Bulletin", 2020, 103 (3) veröffentlicht.