S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Dyakov
Einführung
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary, der Erreger der Spätfäule, der wirtschaftlich wichtigsten Krankheit bei Kartoffeln und Tomaten, hat seit mehr als anderthalb Jahrhunderten die Aufmerksamkeit von Forschern aus verschiedenen Ländern auf sich gezogen. Es tauchte Mitte des XNUMX. Jahrhunderts plötzlich in Europa auf und verursachte eine Kartoffelepidemie, die vielen Generationen in Erinnerung geblieben ist.
Bisher wird es oft als "Pilz des irischen Hungers" bezeichnet. Fast hundert Jahre nach den ersten Epidemien wurden wilde mexikanische Kartoffelarten entdeckt, die gegen Spätbrand resistent waren, Methoden zur Kreuzung mit Kulturkartoffeln entwickelt (Müller, 1935) und die ersten Spätbrand-resistenten Sorten erhalten (Pushkarev, 1937). Bald nach Beginn ihres kommerziellen Anbaus sammelten sich jedoch Rassen des Krankheitserregers der Spätfäule an, die für resistente Sorten virulent waren. und die Einführung neuer Resistenzgene aus wilden mexikanischen Kartoffeln in Sorten begann schnell an Wirksamkeit zu verlieren.
Fehler bei der Verwendung von monogener (vertikaler) Resistenz zwangen die Züchter, nach komplexeren Wegen zu suchen, um unspezifische polygene (horizontale) Resistenz auszunutzen. In den letzten Jahren haben sich in einzelnen Populationen des Parasiten hochaggressive Rassen angesammelt, die zur Erosion selbst unspezifischer Resistenzen führten. Das Aufkommen von fungizidresistenten Stämmen hat Probleme bei der Verwendung von Kartoffelschutzchemikalien verursacht.
Aufgrund der signifikanten Unterschiede zwischen Oomyceten und Pilzen in Bezug auf chemische Zusammensetzung, Ultrastruktur und Stoffwechsel sind Fungizide, insbesondere systemische, die zum Schutz von Pflanzen vor vielen Pilzkrankheiten eingesetzt werden, gegen Oomyceten unwirksam.
Daher wurde beim chemischen Schutz gegen Spätfäule mehrfaches (bis zu 12-mal pro Saison oder mehr) Sprühen mit Kontaktpräparaten mit einem breiten Wirkungsspektrum verwendet. Ein revolutionärer Schritt war die Verwendung von Phenylamiden, die für Oomyceten toxisch sind und sich systemisch in Pflanzen verbreiten. Ihre weit verbreitete Verwendung führte jedoch schnell zur Akkumulation resistenter Stämme in Pilzpopulationen (Davidse et al., 1981), was den Pflanzenschutz erheblich erschwerte. P. infestans ist praktisch der einzige Parasit der gemäßigten Zone, dessen Schaden im ökologischen Landbau ohne den Einsatz chemischer Schutzmittel nicht neutralisiert werden kann (Van Bruggen, 1995).
Das Obige erklärt die enorme Aufmerksamkeit, die Forscher aus verschiedenen Ländern der Untersuchung von P. infestans-Populationen, der Dynamik ihrer Häufigkeit und genetischen Zusammensetzung sowie den genetischen Mechanismen der Variabilität widmen.
Lebenszyklus von R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans entwickelt ein interzelluläres Myzel mit Haustoria in Kartoffelblättern. Wenn es sich von den Geweben des Blattes ernährt, bilden sich dunkle Flecken, die bei nassem Wetter schwarz werden und verrotten. Bei einer starken Niederlage stirbt das gesamte Blatt. Nach einer Fütterungsperiode bilden sich Auswüchse auf dem Myzel - Sporangiophoren -, die durch die Stomata nach außen wachsen. Bei nassem Wetter bilden sie eine weiße Blüte um die Flecken auf der Unterseite der Blätter. An den Enden der Sporangiophoren bilden sich zitronenförmige Zoosporangien, die abbrechen und durch Regenspray übertragen werden (Abb. 1). Sporangien, die auf der Oberfläche eines Kartoffelblatts in Wassertropfen gelangen, keimen mit 6-8 Zoosporen, die nach einer gewissen Bewegung abgerundet, mit einer Schale bedeckt und mit einem Sprossenrohr keimen. Der Spross dringt durch die Stomata in das Blattgewebe ein. Unter bestimmten Bedingungen können Sporangien in einem Wachstumsrohr direkt in Blattgewebe wachsen. Unter günstigen Bedingungen beträgt die Zeit von der Infektion bis zur Bildung einer neuen Sporulation nur 3-4 Tage.
Sobald sie auf dem Boden sind und durch den Boden gefiltert werden, können Sporangien Knollen infizieren. Stark betroffene Knollen verrotten während der Lagerung; Bei den Schwachen kann die Infektion bis zur nächsten Saison bestehen bleiben. Darüber hinaus kann der Erreger der Spätfäule im Winter in Form von Oosporen (dickwandige ruhende sexuelle Sporen) im Boden auf Pflanzenresten und auf Tomatensamen bestehen bleiben. Oosporen werden an lebenden Pflanzenorganen gebildet, wenn Stämme verschiedener Paarungstypen auf übermäßige Feuchtigkeit treffen. Im Frühjahr bildet sich eine asexuelle Sporulation an gepflanzten infizierten Knollen und an Pflanzenresten mit Oosporen. Zoosporen gelangen in den Boden und verursachen eine Infektion der unteren Blätter von Pflanzen. In einigen Fällen kann Myzel aus der infizierten Knolle entlang des grünen Teils der Pflanze wachsen und normalerweise im oberen Teil des Stiels auftreten.
Ein signifikanter Unterschied zwischen Oomyceten und den meisten Pilzen liegt in der Dominanz der Diplophase in ihrem Lebenszyklus mit gametischer Meiose und Keimung von Zygoten (Oosporen) ohne reduktive Kernspaltung. Dieses Merkmal sowie der dipolare Heterotallismus, der die Bisexualität ersetzt, scheinen es möglich zu machen, die für die Untersuchung von Populationen höherer Eukaryoten entwickelten Ansätze (Analyse der Panmixie und Unterteilung von Populationen, Genflüsse innerhalb und zwischen Populationen usw.) auf Oomyceten anzuwenden. Drei Faktoren erlauben es jedoch nicht, diese Ansätze bei der Untersuchung der P. infestans-Populationen vollständig zu übertragen.
1. Zusammen mit hybriden Oosporen werden in Populationen selbstfruchtbare und parthenogenetische Oosporen gebildet (Fife und Shaw, 1992; Anikina et al., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003), und die Häufigkeit ihrer Bildung kann ausreichen, um Einfluss zu nehmen auf die Testergebnisse.
2. Der sexuelle Prozess bei P. infestans leistet einen unbedeutenden Beitrag zur Dynamik der Populationsgröße, da sich der Pilz hauptsächlich durch vegetative Sporen vermehrt und mehr als 90% der Ergebnisse der Analyse des Paarungstyps nach der traditionellen Methode auf einem Nährmedium ausmacht ... In der Vegetationsperiode mehrere Generationen asexueller Sporulation (Entwicklung polyzyklischer Krankheiten). Oosporen spielen eine wichtige Rolle bei der Erhaltung des Organismus in der Zeit ohne grüne Pflanzen (im Winter) und bei der Primärinfektion von Sämlingen. Während des Sommers tritt dann eine klonale Reproduktion und eine Zunahme oder umgekehrt eine Abnahme der Anzahl einzelner Klone auf, die infolge der sexuellen Rekombination entstanden sind, was hauptsächlich durch die Auswahl der besser angepassten Klone bestimmt wird. Daher kann das Verhältnis einzelner Klone in einer Population zu Beginn und am Ende der Epiphytotik völlig unterschiedlich sein.
3. Der beschriebene Zyklus ist charakteristisch für die einheimischen Populationen von P. infestans in ihrer Heimat Mittelamerika. In anderen Regionen der Welt war der sexuelle Prozess mehr als 100 Jahre lang nicht bekannt, das vegetative Myzel in infizierten Kartoffelknollen war das Überwinterungsstadium. Der Lebenszyklus war vollständig agamisch und die Ausbreitung war von zentraler Bedeutung: Die Infektion durch einzelne infizierte gepflanzte Knollen ging auf die Blätter über und bildete primäre Krankheitsherde, die mit der massiven Entwicklung der Krankheit verschmelzen konnten.
So kann es in einigen Regionen zu einem Wechsel von sexuellen und asexuellen Zyklen kommen, während in anderen Regionen nur asexuelle Zyklen auftreten.
Herkunft von P. INFESTANS
P. infestans trat Ende der ersten Hälfte des 1991. Jahrhunderts in Europa auf. Da die Kartoffel im nordöstlichen Teil Südamerikas heimisch ist, wurde angenommen, dass der Parasit während des Booms des chilenischen Salpeters von dort nach Europa gebracht wurde. Studien, die an der Kartoffelstation Rockefeller Center im Toluca-Tal in Mexiko durchgeführt wurden, zwangen jedoch dazu, diesen Standpunkt zu überdenken (Niederhauser, 1993, XNUMX).
1. Im Toluca-Tal weisen lokale Knollenkartoffelarten (Solanum demissum, S. bulbocastanum usw.) unterschiedliche Gengruppen für vertikale Resistenz in Kombination mit einer hohen unspezifischen Resistenz auf, was auf eine lange Koevolution mit dem Parasiten hinweist. Südamerikanischen Arten, einschließlich Kulturkartoffeln, fehlen Resistenzgene.
2. Im Toluca-Tal werden Isolate mit den Paarungstypen A1 und A2 gefunden, wodurch die Mischpopulation von P. infestans weit verbreitet ist. Im südamerikanischen Heimatland der Kartoffelkulturen breitet sich der Parasit klonal aus.
3. Im Toluca-Tal gibt es jährlich schwere Epidemien der Spätfäule. Daher wird unter nordamerikanischen Forschern (Cornell University) die Meinung über Mesoamerika (Mittelamerika) als Geburtsort der Kartoffelphytophthora festgelegt (Goodwin et al., 1994).
Südamerikanische Forscher teilen diese Meinung nicht. Sie glauben, dass die Kulturkartoffel und ihr Parasit P. infestans eine gemeinsame Heimat haben - die südamerikanischen Anden. Sie stützten ihren Standpunkt durch molekulare Studien zur Analyse von DNA-Polymorphismen des mitochondrialen Genoms (mtDNA) und der Kerngene RAS und β-Tubulin (Gomez-Alpizar et al., 2007). Sie zeigten, dass die aus verschiedenen Teilen der Welt gesammelten Stämme von drei unterschiedlichen Ahnenlinien abstammen, die (alle drei) in den südamerikanischen Anden vorkommen. Anden-Haplotypen sind Nachkommen zweier Linien: Isolate der ältesten mtDNA-Linie werden auf wild wachsenden Solanaceae aus dem Abschnitt Anarrhicomenum in Ecuador gefunden, während Isolate der zweiten Linie auf Kartoffeln, Tomaten und wilden Nachtschatten häufig vorkommen. In Toluca stammen sogar seltene Haplotypen von nur einer Linie ab, wobei die genetische Variabilität der Toluca-Stämme (niedrige Allelfrequenz einiger variabler Stellen) auf einen starken Gründereffekt aufgrund der jüngsten Drift hinweist.
Darüber hinaus wurde in den Anden eine neue Art P. andina gefunden, die P. infestans morphologisch und genetisch ähnlich ist und nach Angaben der Autoren auf die Anden als Brennpunkt der Speziation in der Gattung Phytophthora hinweist. Schließlich umfassen in Europa und den Vereinigten Staaten die Populationen von P. infestans beide Andenlinien, während in Toluca nur eine.
Diese Veröffentlichung löste eine Antwort einer Gruppe von Forschern aus verschiedenen Ländern aus, die viele experimentelle Arbeiten zur Überarbeitung der vorherigen Studie durchgeführt hatten (Goss et al., 2014). In dieser Arbeit wurden zunächst informativere Mikrosatelliten-DNA-Sequenzen verwendet, um DNA-Polymorphismen zu untersuchen. zweitens für die Analyse von Clustering, Migrationspfaden, Zeit der Divergenz von Populationen usw. Es wurden fortgeschrittenere Modelle verwendet (F-Statistik, Bayes'sche Näherungen usw.), und drittens wurde ein Vergleich nicht nur mit der Andenart P. andina verwendet, bei der eine hybride Natur festgestellt wurde (P. infestans x Phytophthora sp.). , aber auch mit den mexikanischen endemischen Arten P. mirabilis, P. Ipomoeae und Phytophthora phaseoli - genetisch nahe P. infestans derselben Klade (Kroon et al., 2012). Als Ergebnis dieser Analysen wurde eindeutig gezeigt, dass der Wurzelteil des phylogenetischen Baums aller in die Studie einbezogenen Arten der Gattung Phytophthora mit Ausnahme des Hybrids P. andina zu mexikanischen Stämmen gehört und der Migrationsfluss die Richtung Mexiko - Anden und nicht umgekehrt hat und sein Beginn mit dem europäischen übereinstimmt Kolonisierung der Neuen Welt (vor 300-600 Jahren). Somit trat das Auftreten der P. infestans-Spezies, die auf die Niederlage von Kartoffeln spezialisiert ist, im sekundären genetischen Zentrum der Bildung von knolligen Nachtschatten auf, d.h. in Mittelamerika.
Genom von P. INFESTANS
2009 sequenzierte ein internationales Wissenschaftlerteam das gesamte Genom von P infestans (Haas et al., 2009), dessen Größe 240 MB betrug. Dies ist um ein Vielfaches höher als bei eng verwandten Arten P. sojae (95 Mb), die Wurzelfäule bei Sojabohnen verursachen, und P. Ramorum (65 Mb), die so wertvolle Baumarten wie Eiche, Buche und einige andere befallen. Die erhaltenen Daten zeigten, dass das Genom eine große Anzahl von Kopien wiederholter Sequenzen enthält - 74%. Das Genom enthält 17797 proteinkodierende Gene, von denen die meisten Gene sind, die an zellulären Prozessen beteiligt sind, einschließlich DNA-Replikation, Transkription und Translation von Proteinen.
Ein Vergleich der Genome der Gattung Phytophthora ergab eine ungewöhnliche Organisation des Genoms, bestehend aus Blöcken von Sequenzen konservierter Gene, in denen die Gendichte relativ hoch und der Gehalt an wiederholten Sequenzen relativ niedrig ist, und einzelnen Regionen mit nicht konservierten Gensequenzen mit einer geringen Gendichte und einem hohen Gehalt an sich wiederholenden Regionen. Konservative Blöcke machen 70% (12440) aller P. infestans-Protein-kodierenden Gene aus. Innerhalb konservativer Blöcke sind Gene normalerweise eng beieinander mit einem durchschnittlichen intergenen Abstand von 604 bp. In Bereichen zwischen konservativen Blöcken ist der intergene Abstand aufgrund einer Zunahme der Dichte sich wiederholender Elemente größer (3700 bp). Sich schnell entwickelnde Effektor-Sekretionsgene befinden sich in genarmen Regionen.
Die Sequenzanalyse des P. Infestans-Genoms zeigte, dass ungefähr ein Drittel des Genoms zu transponierbaren Elementen gehört. Das Genom von P. infestans enthält signifikant mehr verschiedene Transposonfamilien als andere bekannte Genome. Die meisten Transposons von P. infestans gehören zur Familie der Zigeuner.
Im Genom von P. infestans wurde eine große Anzahl spezifischer Genfamilien identifiziert, die an der Pathogenese beteiligt sind. Ein erheblicher Teil von ihnen codiert Effektorproteine, die die Physiologie der Wirtspflanze verändern und zu ihrer Infektion beitragen. Sie lassen sich in zwei große Kategorien einteilen: apoplastische Effektoren, die in den Interzellularräumen (Apoplasten) wirken, und cytoplasmatische Effektoren, die über Haustorien in Zellen gelangen. Apoplastische Effektoren umfassen sekretierte hydrolytische Enzyme wie Proteasen, Lipasen und Glycosylasen, die Pflanzenzellen zerstören; Inhibitoren von Wirtspflanzenabwehrenzymen und nekrotisierenden Toxinen wie Nep1-ähnlichen Proteinen (NPLs) und Pcf-ähnlichen kleinen cysteinreichen Proteinen (SCRs).
Die Effektorgene von P. infestans sind zahlreich und normalerweise größer als nicht pathogene Gene. Am bekanntesten sind die cytoplasmatischen Effektoren RXLR und Crinkler (CNR). Die typischen zytoplasmatischen Effektoren von Oomyceten sind RXLR-Proteine. Alle bisher entdeckten RXLR-Effektorgene enthalten die aminoterminale Gruppe Arg-XLeu-Arg, wobei X eine Aminosäure ist. Als Ergebnis der Studie wurde vermutet, dass das Genom von P. infestans 563 RXLR-Gene enthält, 60% mehr als bei P. sojae und P. ramorum. Ungefähr die Hälfte der RXLR-Gene im Genom von P. infestans sind speziesspezifisch. RXLR-Effektoren haben eine Vielzahl von Sequenzen. Unter ihnen wurden eine große und 150 kleine Familien identifiziert. Im Gegensatz zum Hauptproteom befinden sich die RXLR-Effektorgene normalerweise in genarmen und wiederholungsreichen Regionen des Genoms. Die mobilen Elemente, die die Dynamik dieser Regionen bestimmen, erleichtern die Rekombination in diesen Genen.
Cytoplasmatische CRN-Effektoren wurden ursprünglich in P. infestans-Transkripten identifiziert, die für Nekrose-Peptide aus Pflanzengewebe kodieren. Seit ihrer Entdeckung ist wenig über die Familie dieser Effektoren bekannt. Die Analyse des P. Infestans-Genoms ergab eine große Familie von 196 CRN-Genen, die signifikant größer ist als bei P. sojae (100 CRN) und P. ramorum (19 CRN). CRNs sind wie RXLRs modulare Proteine und bestehen aus einer hochkonservierten N-terminalen LFLAK-Domäne (50 Aminosäuren) und einer benachbarten DWL-Domäne, die verschiedene Gene enthält. Die meisten CRNs (60%) besitzen ein Signalpeptid.
Die Möglichkeit verschiedener CRNs, die zellulären Prozesse der Wirtspflanze zu stören, wurde untersucht. Bei der Analyse der Pflanzennekrose ermöglichte die Entfernung von CRN2-Proteinen die Identifizierung der C-terminalen Region, die aus 234 Aminosäuren (Positionen 173-407, DXG-Domäne) besteht und den Zelltod verursacht. Die Analyse der CRN-Gene von P. infestans ergab vier verschiedene C-terminale Regionen, die auch den Zelltod innerhalb der Pflanze verursachen. Dazu gehören die neu identifizierten DC-Domänen (P. Infestans hat 18 Gene und 49 Pseudogene) sowie D2- (14 und 43) und DBF- (2 und 1) Domänen, die Proteinkinasen ähnlich sind. Proteine von CRN-Domänen, die in einer Pflanze exprimiert werden, werden (in Abwesenheit von Signalpeptiden) in einer Pflanzenzelle konserviert und stimulieren den Zelltod durch einen intrazellulären Mechanismus. Weitere 255 Sequenzen, die CRN-Domänen enthalten, fungieren höchstwahrscheinlich nicht als Gene.
Die Zunahme der Anzahl und Größe der RXLR- und CRN-Effektor-Genfamilien war vermutlich auf nicht allelische homologe Rekombination und Genduplikation zurückzuführen. Trotz der Tatsache, dass das Genom eine große Anzahl aktiver mobiler Elemente enthält, gibt es immer noch keinen direkten Beweis für den Transfer von Effektorgenen.
Methoden zur Untersuchung der Bevölkerungsstruktur
Die Untersuchung der genetischen Struktur von Populationen basiert derzeit auf der Analyse von Reinkulturen ihrer Stammbestandteile. Die Analyse von Populationen ohne Isolierung reiner Pflanzen wird auch für bestimmte Zwecke durchgeführt, beispielsweise um die Aggressivität einer Population oder das Vorhandensein von Stämmen, die gegen Fungizide resistent sind, zu untersuchen (Filippov et al., 2004; Derevyagina et al., 1999). Diese Art der Forschung beinhaltet die Verwendung spezieller Methoden, deren Beschreibung den Rahmen dieser Überprüfung sprengt. Für die vergleichende Analyse von Stämmen wird eine Reihe von Methoden verwendet, die sowohl auf der Analyse der DNA-Struktur als auch auf der Untersuchung phänotypischer Manifestationen beruhen. Die vergleichende Analyse von Populationen muss sich mit einer großen Anzahl von Isolaten befassen, was bestimmte Anforderungen an die verwendeten Methoden stellt. Idealerweise sollten sie die folgenden Anforderungen erfüllen (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- billig und einfach zu implementieren sein, keine erheblichen Zeitkosten erfordern, auf allgemein verfügbaren Technologien basieren (z. B. PCR);
- muss eine ausreichend große Anzahl unabhängiger codominanter Markermerkmale erzeugen;
- eine hohe Reproduzierbarkeit aufweisen;
- Verwenden Sie die zu untersuchende Mindestmenge an Gewebe.
- spezifisch für das Substrat sein (die in der Kultur vorhandene Kontamination sollte die Ergebnisse nicht beeinflussen);
- erfordern keine gefährlichen Verfahren und hochgiftigen Chemikalien.
Leider gibt es keine Methoden, die allen oben genannten Parametern entsprechen. Für eine vergleichende Untersuchung der Stämme in unserer Zeit werden Methoden verwendet, die auf der Analyse phänotypischer Merkmale basieren: Virulenz gegenüber Kartoffel- und Tomatensorten (Kartoffel- und Tomatenrassen), Paarungstyp, Spektren von Peptidase-Isoenzymen und Glucose-6-Phosphat-Isomerase sowie Analyse der DNA-Struktur: Längenpolymorphismus Restriktionsfragment (RFLP), das üblicherweise mit einer Hybridisierungssonde RG 57 ergänzt wird, Analyse von Mikrosatelliten-Wiederholungen (SSR und InterSSR), Amplifikation mit zufälligen Primern (RAPD), Amplifikation von Restriktionsfragmenten (AFLP), Amplifikation mit Primern, die homolog zu den Sequenzen mobiler Elemente sind (z. B. Inter SINE PCR), Bestimmung mitochondrialer DNA-Haplotypen.
Kurze Beschreibung der Methoden zur vergleichenden Untersuchung von Stämmen, die bei der Arbeit mit P. Infestans verwendet wurden
Phänotypische Markermerkmale
"Kartoffel" -Rennen
"Kartoffel" -Rassen sind ein häufig erforschter und verwendeter Marker. "Einfache Kartoffel" -Rassen haben ein Gen für Kartoffelvirulenz, "komplexe" - mindestens zwei. Black et al. (1953), die alle ihnen zur Verfügung stehenden Daten zusammenfassten, stellten fest, dass die Phytophthora-Rasse Pflanzen mit dem Resistenzgen / den Resistenzgenen infizieren kann, die dem P. infestans-Virulenzgen / den Virulenzgenen entsprechen, und fanden die Rassen 1, 2, 3 und 4, die Pflanzen infizieren mit den Genen R1, R2, R3 bzw. R4, d.h. Die Wechselwirkung zwischen dem Parasiten und dem Wirt erfolgt nach dem Gen-für-Gen-Prinzip. Ferner entdeckte Black unter Beteiligung von Gallegly und Malcolmson die Resistenzgene R5, R6, R7, R8, R9, R10 und R11 sowie die entsprechenden Rassen (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Es gibt umfangreiche Daten zur Rassenzusammensetzung des Erregers aus verschiedenen Regionen. Ohne diese Daten im Detail zu analysieren, werden wir nur einen allgemeinen Trend anzeigen: Wo Sorten mit neuen Resistenzgenen oder deren Kombinationen verwendet wurden, gab es zunächst eine gewisse Schwächung der Spätfäule, aber dann traten Rassen mit den entsprechenden Virulenzgenen auf und wurden ausgewählt und Ausbrüche der Spätfäule wieder aufgenommen. Eine spezifische Virulenz gegen die ersten 4 Resistenzgene (R1-R4) wurde in den Sammlungen, die vor der Einführung in die Kultivierung von Sorten mit diesen Genen gesammelt wurden, selten beobachtet, aber die Anzahl der virulenten Stämme nahm stark zu, wenn der Erreger auf Sorten parasitiert wurde, die diese Gene tragen. Die Gene 5-11 waren dagegen in Sammlungen weit verbreitet (Shaw, 1991).
Eine Ende der 1980er Jahre durchgeführte Untersuchung des Verhältnisses verschiedener Rassen während der Vegetationsperiode zeigte, dass zu Beginn der Entwicklung der Krankheit Klone mit geringer Aggressivität und 1-2 Virulenzgenen in der Bevölkerung überwiegen.
Ferner nimmt mit der Entwicklung der Spätfäule die Konzentration der ursprünglichen Klone ab und die Anzahl der "komplexen" Rassen mit hoher Aggressivität nimmt zu. Das Auftreten der letzteren bis zum Ende der Saison erreicht 100%. Bei der Lagerung von Knollen nimmt die Aggressivität ab und einzelne Virulenzgene gehen verloren. Die Dynamik des Klonersatzes kann bei verschiedenen Sorten auf unterschiedliche Weise auftreten (Rybakova & Dyakov, 1990). Unsere Studien in den Jahren 2000-2010 zeigten jedoch, dass bei Rassen, die sowohl aus Kartoffeln als auch aus Tomaten isoliert wurden, seit Beginn der Epiphytotik komplexe Rassen auftreten. Dies ist wahrscheinlich auf Veränderungen in der Population von P. Infestans in Russland zurückzuführen.
Von 1988 bis 1995 erreichte die Häufigkeit des Auftretens von "Superraces" mit allen oder fast allen Virulenzgenen in verschiedenen Regionen 70 bis 100%. Diese Situation wurde beispielsweise in Belarus, in den Regionen Leningrad und Moskau, in Nordossetien und in Deutschland festgestellt (Ivanyuk et al., 2002a, 2002b; Polityko, 1994; Schober-Butin et al., 1995).
"Tomaten" Rennen
In Tomatensorten wurden nur 2 Gene für Resistenz gegen Spätfäule gefunden - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) und Ph2 (Al-Kherb, 1988). Wie bei den Kartoffelrassen erfolgt die Wechselwirkung zwischen Tomaten und P. infestans gen-für-gen. Die T0-Rasse infiziert Sorten ohne Resistenzgene (die meisten industriell verwendeten Sorten), die T1-Rasse infiziert Sorten mit dem Ph1-Gen (Ottawa) und die T2-Rasse infiziert Sorten mit dem Ph2-Gen.
In Russland wurde fast ausschließlich T0 auf Kartoffeln gefunden; T0 überwog zu Beginn der Saison bei Tomaten, wurde aber später durch das T1-Rennen ersetzt (Dyakov et al., 1975, 1994). Nach 2000 trat T1 bei Kartoffeln in vielen Populationen zu Beginn der epiphytotischen Periode auf. In den Vereinigten Staaten waren Kartoffelstämme für Tomaten sowie die Rassen T0, T1 und T2 nicht pathogen, während T1 und T2 bei Tomaten vorherrschten (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin et al., 1995).
Paarungstyp
Für die Studie sind Teststämme (Referenzstämme) mit bekannten Paarungstypen A1 und A2 erforderlich. Das Testisolat wird mit ihnen paarweise in Petrischalen mit Haferagarmedium inokuliert. Nach 10-tägiger Inkubation werden die Platten auf das Vorhandensein oder Fehlen von Oosporen im Medium in der Kontaktzone der Stämme untersucht. Es gibt 4 Optionen: Der Stamm gehört zum A1-Paarungstyp, wenn er mit dem A2-Tester Oosporen bildet, zu A2, wenn er mit dem A1-Tester Oosporen bildet, zu A1A2, wenn er mit beiden Testern Oosporen bildet, oder ist steril (00), wenn er keine Oosporen bildet ohne Tester (die letzten beiden Gruppen sind selten).
Um die Arten der Paarung schneller zu bestimmen, wurden Versuche unternommen, Regionen des Genoms zu identifizieren, die mit der Art der Paarung assoziiert sind, mit dem Ziel ihrer weiteren Verwendung, um die Art der Paarung durch PCR zu bestimmen. Eines der ersten erfolgreichen Experimente zur Identifizierung einer solchen Stelle wurde von amerikanischen Forschern durchgeführt (Judelson et al., 1995). Unter Verwendung der RAPD-Methode konnten sie die mit dem Paarungstyp assoziierte W16-Region in den Nachkommen der beiden gekreuzten Isolate identifizieren und ein Paar von 24-bp-Primern entwerfen, um sie zu amplifizieren (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') und W16-2 (5') -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Nach Restriktion des PCR-Produkts mit dem Restriktionsenzym HaeIII konnten Isolate mit den Paarungstypen A1 und A2 getrennt werden.
Ein weiterer Versuch, PCR-Marker zur Bestimmung der Paarungstypen zu erhalten, wurde von koreanischen Forschern unternommen (Kim, Lee, 2002). Sie identifizierten bestimmte Produkte mit der AFLP-Methode. Als Ergebnis wurde ein Primerpaar PHYB-1 (vorwärts) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') und PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3') entwickelt, das eine selektive Amplifikation der mit dem A2-Paarungstyp assoziierten Genomregion ermöglicht. Anschließend setzten sie diese Arbeit fort und entwarfen die Primer 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, vorwärts) und 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), die eine selektive Amplifikation der Mat-A1-Region ermöglichten, die für Stämme mit Paarungstyp charakteristisch ist A1. Die Verwendung der PCR-Diagnostik von Paarungstypen zeigte gute Ergebnisse bei der Untersuchung von Populationen von P. infestans in der Tschechischen Republik (Mazakova et al., 2006), Tunesien (Jmour, Hamada, 2006) und anderen Regionen. In unserem Labor (Mytsa, Elansky, unveröffentlicht) wurden 34 P. infestans-Stämme analysiert, die aus erkrankten Kartoffel- und Tomatenorganen in verschiedenen Regionen Russlands (Regionen Kostroma, Ryazan, Astrakhan und Moskau) isoliert wurden. Die Ergebnisse der PCR-Analyse unter Verwendung spezifischer Primer von mehr als 90% stimmten mit den Ergebnissen der Analyse des Paarungstyps nach der traditionellen Methode auf einem Nährmedium überein.
Tabelle 1. Variabilität der Resistenz innerhalb des Sib 1-Klons (Elansky et al., 2001)
Ort der Probenentnahme | Anzahl der analysierten Isolate | Anzahl empfindlicher (S), schwach resistenter (SR) und resistenter (R) Stämme, Stk. (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Wladiwostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnojarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Jekaterinburg Stadt | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sachalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Omsk Region | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Metalaxylresistenz als Populationsmarker
In den frühen 1980er Jahren wurden in verschiedenen Regionen starke Ausbrüche der Spätfäule durch Metalaxyl-resistente P. infestans-Stämme festgestellt. Kartoffelfarmen in vielen Ländern haben erhebliche Verluste erlitten (Dowley & O'Sullivan, 1981; Davidse et al., 1983; Derevyagina, 1991). Seitdem wurde in vielen Ländern der Welt eine ständige Überwachung des Auftretens von Phenylamid-resistenten Stämmen in Populationen von P. infestans durchgeführt. Neben einer praktischen Bewertung der Aussichten für die Verwendung von Phenylamid-haltigen Arzneimitteln, dem Aufbau eines Systems von Schutzmaßnahmen und der Vorhersage von Epiphytotien ist die Resistenz gegen diese Arzneimittel zu einem der Markierungsmerkmale geworden, die häufig für die vergleichende Analyse von Populationen dieses Pathogens verwendet werden. Die Verwendung der Resistenz gegen Metalaxyl in vergleichenden Populationsstudien sollte jedoch unter Berücksichtigung der Tatsache erfolgen, dass: 1 - die genetische Basis der Resistenz noch nicht genau bestimmt wurde, 2 - die Resistenz gegen Metalaxyl ein selektiv abhängiges Merkmal ist, das sich je nach Verwendung von Phenylamiden ändern kann, 3 - unterschiedlich der Grad der Empfindlichkeit gegenüber Metalaxylstämmen innerhalb einer klonalen Linie (Tabelle 1).
Spektren von Isozymen
Isozym-Marker sind normalerweise unabhängig von äußeren Bedingungen, zeigen eine Mendelsche Vererbung und sind codominant, wodurch zwischen Homo- und Heterozygoten unterschieden werden kann. Die Verwendung von Proteinen als Genmarker ermöglicht es, sowohl große Reorganisationen des genetischen Materials, einschließlich chromosomaler und genomischer Mutationen, als auch Substitutionen einzelner Aminosäuren zu identifizieren.
Elektrophoretische Untersuchungen von Proteinen haben gezeigt, dass die meisten Enzyme in Organismen in Form mehrerer Fraktionen existieren, die sich in der elektrophoretischen Mobilität unterscheiden. Diese Fraktionen sind das Ergebnis der Codierung mehrerer Formen von Enzymen durch verschiedene Loci (Isozyme oder Isozyme) oder durch verschiedene Allele desselben Locus (Allozyme oder Alloenzyme). Das heißt, Isozyme sind verschiedene Formen eines Enzyms. Verschiedene Formen haben die gleiche katalytische Aktivität, unterscheiden sich jedoch geringfügig in einzelnen Aminosäuresubstitutionen im Peptid und in der Ladung. Solche Unterschiede zeigen sich bei der Elektrophorese.
Bei der Untersuchung von P. infestans-Stämmen werden die Spektren von Isoenzymen zweier Proteine, Peptidase und Glucose-6-phosphat-Isomerase, verwendet (dieses Enzym ist in russischen Populationen monomorph; daher werden die Methoden seiner Untersuchung in dieser Arbeit nicht vorgestellt). Um sie in einem elektrischen Feld in Isozyme zu trennen, werden aus den untersuchten Organismen isolierte Proteinpräparate auf eine in einem elektrischen Feld angeordnete Gelplatte aufgetragen. Die Diffusionsrate einzelner Proteine im Gel hängt von der Ladung und dem Molekulargewicht ab. Daher wird in einem elektrischen Feld die Proteinmischung in einzelne Fraktionen aufgeteilt, die mit speziellen Farbstoffen sichtbar gemacht werden können.
Die Untersuchung von Peptidase-Isoenzymen wird an Celluloseacetat-, Stärke- oder Polyacrylamidgelen durchgeführt. Am bequemsten ist das Verfahren, das auf der Verwendung von Celluloseacetatgelen basiert, die von Helena Laboratories Inc. hergestellt werden. Es erfordert keine großen Mengen an Testmaterialien, es ermöglicht es, nach der Elektrophorese für beide Enzymorte kontrastierende Banden auf dem Gel zu erhalten, seine Implementierung erfordert keine großen Zeit- und Materialkosten (Fig. 2).
Ein kleines Stück Myzel wird in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen überführt, 1-2 Tropfen destilliertes Wasser werden hinzugefügt. Danach wird die Probe homogenisiert (z. B. mit einer elektrischen Bohrmaschine mit einem für ein Mikroröhrchen geeigneten Kunststoffaufsatz) und 25 Sekunden lang auf einer Zentrifuge bei 13000 U / min sedimentiert. 8 μl aus jedem Mikroröhrchen. Der Überstand wird auf die Applikatorplatte übertragen.
Das Celluloseacetatgel wird aus dem Pufferbehälter entfernt, zwischen zwei Blatt Filterpapier getupft und mit der Arbeitsschicht auf die Kunststoffbasis des Applikators gelegt. Die Lösung von der Platte wird vom Applikator 2-4 mal auf das Gel übertragen. Das Gel wird in eine Elektrophoresekammer überführt,
Tabelle 2. Die Zusammensetzung der Lösung, die zum Färben von Celluloseacetatgel bei der Analyse von Peptidase-Isoenzymen verwendet wird, ein Farbtropfen (Bromphenolblau) wird auf den Rand des Gels gegeben.
TRIS HCl, 0,05 M, Ph 8,0 2 ml
Peroxidase, 1000 U / ml 5 Tropfen
o-Dianisidin, 4 mg / ml 8 Tropfen
MgCl 2, 20 mg / ml 2 Tropfen
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 Tropfen
L-Aminosäureoxidase, 20 U / ml 2 Tropfen
Die Elektrophorese wird 20 Minuten lang durchgeführt. bei 200 V. Nach der Elektrophorese wird das Gel auf einen Malertisch übertragen und mit einer speziellen Lackierlösung angefärbt (Tabelle 2). 10 ml 1,6% iger DIFCO-Agar werden vorab in einem Mikrowellenofen geschmolzen, auf 60 ° C abgekühlt, wonach 2 ml Agar mit einer Farbmischung gemischt und auf das Gel gegossen werden. Streifen erscheinen innerhalb von 15-20 Minuten. Das L-Aminosäureoxidase-Reagenz wird unmittelbar vor dem Mischen der Lösung mit geschmolzenem Agar zugegeben.
In russischen Populationen wird der Pep 1-Locus durch die Genotypen 100/100 und 92/100 dargestellt. Homozygote 92/92 ist äußerst selten (etwa 0,1%). Locus Rehr 2 wird durch drei Genotypen 100/100, 100/112 und 112/112 dargestellt, und alle drei Varianten sind ziemlich häufig (Elanky und Smirnov, 3, Abb. 2003).
Genomforschung
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus mit anschließender Hybridisierung (RFLP-RG 57)
Die gesamte DNA wird mit dem Restriktionsenzym Eco R1 behandelt, DNA-Fragmente werden durch Elektrophorese in Agarosegel aufgetrennt. Die Kern-DNA ist sehr groß und weist viele sich wiederholende Sequenzen auf. Daher ist es schwierig, die zahlreichen Fragmente, die durch die Wirkung von Restriktionsenzymen erhalten werden, direkt zu analysieren. Daher werden die im Gel getrennten DNA-Fragmente auf eine spezielle Membran übertragen und zur Hybridisierung mit der RG 57-Sonde verwendet, die mit radioaktiven oder fluoreszierenden Markierungen markierte Nukleotide enthält. Diese Sonde hybridisiert mit repetitiven genomischen Sequenzen (Goodwin et al., 1992, Forbes et al., 1998). Nach Visualisierung der Ergebnisse der Hybridisierung auf einem leichten oder radioaktiven Material wird ein Multi-Locus-Hybridisierungsprofil (Fingerprinting) erhalten, das durch 25-29 Fragmente dargestellt wird (Forbes et al., 1998). Asexuelle (klonale) Nachkommen haben die gleichen Profile. Durch die Anordnung der Banden im Elektrophoretogramm werden die Ähnlichkeiten und Unterschiede der verglichenen Organismen beurteilt.
Mitochondriale DNA-Haplotypen
In den meisten eukaryotischen Zellen liegt die mtDNA in Form eines doppelsträngigen zirkulären DNA-Moleküls vor, das sich im Gegensatz zu den Kernchromosomen eukaryotischer Zellen halbkonservativ repliziert und nicht mit Proteinmolekülen assoziiert ist.
Das mitochondriale Genom von P. infestans wurde sequenziert, und eine Reihe von Arbeiten befasste sich mit der Analyse der Restriktionsfragmentlängen (Carter et al., 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Nachdem Griffith und Shaw (1998) eine einfache und schnelle Methode zur Bestimmung von mtDNA-Haplotypen entwickelt hatten, wurde dieser Marker zu einem der beliebtesten in P. Infestans-Studien. Die Essenz der Methode besteht in der sequentiellen Amplifikation von zwei mitochondrialen DNA-Fragmenten (aus dem gemeinsamen Genom) mit den Primern F2-R2 und F4-R4 (Tabelle 3) und ihre anschließende Restriktion mit den Restriktionsenzymen MspI (1. Fragment) und EcoR1 (2. Fragment). Mit dieser Methode können Sie 4 Haplotypen identifizieren: Ia, IIa, Ib, IIb. Typ II unterscheidet sich von Typ I durch das Vorhandensein eines Inserts mit einer Größe von 1881 bp und durch eine andere Position von Restriktionsstellen in den Regionen P2 und P4 (Fig. 3).
Seit 1996 wurden unter den auf russischem Territorium gesammelten Stämmen nur die Haplotypen Ia und IIa festgestellt (Elansky et al., 2001, 2015). Sie können nach Trennung von Restriktionsprodukten mit dem Primer F2-R2 in einem elektrischen Feld identifiziert werden (Abb. 4, 5). Arten von mtDNA werden bei der vergleichenden Analyse von Stämmen und Populationen verwendet. In einer Reihe von Studien wurden Arten mitochondrialer DNA verwendet, um klonale Linien zu isolieren und P. infestans-Isolate zu passportieren (Botez et al., 2007; Shein et al., 2009). Unter Verwendung der PCR-RFLP-Methode wurde geschlossen, dass mtDNA im gleichen P. infestans-Stamm heterogen ist (Elansky und Milyutina, 2007). Amplifikationsbedingungen: 1x (500 Sek. 94 ° C), 40x (30 Sek. 90 ° C, 30 Sek. 52 ° C, 90 Sek. 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Reaktionsgemisch: (20 μl): 0,2 U Taq-DNA-Polymerase, 1 × 2,5 mM MgCl 2 -Taq-Puffer, jeweils 0,2 mM dNTP, 30 pM Primer und 5 ng der analysierten DNA, entionisiertes Wasser - bis zu 20 μl.
Die Restriktion des PCR-Produkts wird für 4-6 Stunden bei einer Temperatur von 37 ° C durchgeführt. Restriktionsmischung (20 & mgr; l): 10 × MspI (2 & mgr; l), 10 × Restriktionspuffer (2 & mgr; l), entionisiertes Wasser (6 & mgr; l), PCR-Produkt (10 & mgr; l).
Tabelle 3. Primer, die zur Amplifikation von polymorphen mtDNA-Regionen verwendet werden
Ort | Grundierung | Grundierungslänge und Platzierung | PCR-Produktlänge | Restrictase |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'-TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'-TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'-TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
Random Primer Amplification (RAPD)
Bei der Durchführung von RAPD wird ein Primer (manchmal mehrere Primer gleichzeitig) mit einer beliebigen Nukleotidsequenz, üblicherweise 10 Nukleotide lang, mit einem hohen Gehalt (von 50%) an GC-Nukleotiden und einer niedrigen Annealingtemperatur (etwa 35 ° C) verwendet. Solche Primer "landen" an zahlreichen komplementären Stellen im Genom. Nach der Amplifikation wird eine große Anzahl von Amplikons erhalten. Ihre Anzahl hängt von den verwendeten Primern und den Reaktionsbedingungen (MgCl 2 -Konzentration und Annealingtemperatur) ab.
Die Visualisierung der Amplikons erfolgt durch Destillation in Polyacrylamid oder Agarosegel. Bei der Durchführung einer RAPD-Analyse muss die Reinheit des analysierten Materials sorgfältig überwacht werden, da Eine Kontamination mit anderen lebenden Objekten kann zu einer signifikanten Zunahme der Anzahl von Artefakten führen, die selbst bei der Analyse von reinem Material sehr zahlreich sind (Perez et al., 1998). Die Verwendung dieser Methode bei der Untersuchung des Genoms von P. infestans spiegelt sich in vielen Arbeiten wider (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire et al., 2002, Carlisle et al., 2001). Die Auswahl der Reaktionsbedingungen und Primer (51 10-Nucleotid-Primer wurden untersucht) ist in dem Artikel von Abu-El Samen et al. (2003) angegeben.
Mikrosatelliten-Wiederholungsanalyse (SSR)
Mikrosatelliten-Wiederholungen (einfache Sequenzwiederholungen, SSR) sind tandemartig wiederholte kurze Sequenzen von 1-3 (manchmal bis zu 6) Nukleotiden, die im Kerngenom aller Eukaryoten vorhanden sind. Die Anzahl aufeinanderfolgender Wiederholungen kann von 10 bis 100 variieren. Mikrosatelliten-Loci treten mit einer ziemlich hohen Häufigkeit auf und sind mehr oder weniger gleichmäßig im gesamten Genom verteilt (Lagercrantz et al., 1993). Der Polymorphismus von Mikrosatellitensequenzen ist mit Unterschieden in der Anzahl der Wiederholungen des Grundmotivs verbunden. Mikrosatelliten-Marker sind codominant, was es ermöglicht, sie zur Analyse der Populationsstruktur, zur Bestimmung der Verwandtschaft, der Genotyp-Migrationsrouten usw. zu verwenden. Unter anderen Vorteilen dieser Marker sollte man ihren hohen Polymorphismus, ihre gute Reproduzierbarkeit, Neutralität und die Fähigkeit zur Durchführung einer automatischen Analyse und Bewertung beachten. Die Analyse des Polymorphismus von Mikrosatelliten-Wiederholungen wird durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primern durchgeführt, die zu einzigartigen Sequenzen komplementär sind, die Mikrosatelliten-Loci flankieren. Zunächst wurde die Analyse mit der Trennung der Reaktionsprodukte auf einem Polyacrylamidgel durchgeführt. Später schlugen Mitarbeiter von Applied Biosystems vor, fluoreszenzmarkierte Primer zum Nachweis von Reaktionsprodukten unter Verwendung eines automatischen Laserdetektors (Diehl et al., 1990) und dann standardmäßige automatische DNA-Sequenzierer (Ziegle et al., 1992) zu verwenden. Die Markierung von Primern mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen ermöglicht es, mehrere Marker gleichzeitig auf einer Spur zu analysieren und dementsprechend die Produktivität des Verfahrens signifikant zu erhöhen und die Genauigkeit der Analyse zu erhöhen.
Die ersten Veröffentlichungen zur Verwendung der SSR-Analyse für die Untersuchung von P. infestans erschienen Anfang der 2000er Jahre. (Knapova, Gisi, 2002). Nicht alle von den Autoren vorgeschlagenen Marker zeigten einen ausreichenden Grad an Polymorphismus, jedoch wurden zwei von ihnen (4B und G11) in den Satz von 12 SSR-Markern aufgenommen, die von Lees et al. (2006) vorgeschlagen und anschließend vom Eucablight-Forschungsnetzwerk (www.eucablight) übernommen wurden .org) als Standard für P. infestans. Einige Jahre später wurde eine Studie zur Schaffung eines Systems zur Multiplexanalyse von P. infestans-DNA auf der Basis von acht SSR-Markern veröffentlicht (Li et al., 2010). Nachdem alle zuvor vorgeschlagenen Marker bewertet und die aussagekräftigsten ausgewählt sowie Primer, Fluoreszenzmarkierungen und Amplifikationsbedingungen optimiert worden waren, präsentierte dieselbe Autorengruppe ein System für die einstufige Multiplexanalyse, einschließlich 12 Markern (Tabelle 4; Li et al. , 2013a). Die in diesem System verwendeten Primer wurden ausgewählt und mit einem von vier fluoreszierenden Markern (FAM, VIC, NED, PET) markiert, so dass sich die Bereiche der Allelgrößen von Primern mit denselben Markierungen nicht überlappten.
Die Autoren führten die Analyse an einem PTC200-Verstärker (MJ Research, USA) unter Verwendung von QIAGEN-Multiplex-PCR-Kits oder QIAGEN Typeit Microsatellite-PCR-Kits durch. Das Volumen des Reaktionsgemisches betrug 12.5 µl. Die Amplifikationsbedingungen waren wie folgt: für QIAGEN-Multiplex-PCR: 95 ° C (15 min), 30x (95 ° C (20 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (60 s), 72 ° C (20 min); für QIAGEN Type-it-Mikrosatelliten-PCR: 95 ° C (5 min), 28 × (95 ° C (30 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (20 s), 60 ° C (30 min).
Die Trennung und Visualisierung von PCR-Produkten wurde unter Verwendung eines automatischen Kapillar-DNA-Analysators ABI3730 (Applied Biosystems) durchgeführt.
Tabelle 4. Eigenschaften von 12 Standard-SSR-Markern, die für die Genotypisierung von P. Infestans verwendet wurden (Li et al., 2013a)
Name | Anzahl der Allele | Größenbereich Allele (bp) | Grundierungen |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
Pi02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTCAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACAACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | FAM-TCTTGTTCGAGTATGGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
Pi04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
Pi70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
Pi63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAACGAGGGTTTGTAGATT |
Ein Beispiel für die Visualisierung der Analyseergebnisse ist in Abb. 6 dargestellt. 3.7. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung der GeneMapper 1-Software analysiert, indem die erhaltenen Daten mit denen bekannter Isolate verglichen wurden. Um die Interpretation der Analyseergebnisse zu erleichtern, müssen in jede Studie 2-XNUMX Referenzisolate mit einem bekannten Genotyp aufgenommen werden.
Die vorgeschlagene Forschungsmethode wurde an einer signifikanten Anzahl von Feldproben getestet, wonach die Autoren eine Standardisierung der Protokolle zwischen Laboratorien von zwei Organisationen, dem James Hutton Institute (UK) und der Wageningen University & Research (Niederlande), durchführten, wobei zusammen mit der Möglichkeit die Verwendung von Standard-FTA-Karten zur Vereinfachung möglich war Die Entnahme und der Versand von P. infestans-DNA-Proben ermöglichten es, über die Möglichkeit einer kommerziellen Verwendung dieser Entwicklung zu sprechen. Darüber hinaus ermöglichte eine schnelle und genaue Methode zur Genotypisierung von P. infestans-Isolaten unter Verwendung einer Multiplex-SSR-Analyse die Durchführung standardisierter Studien von Populationen dieses Pathogens auf globaler Ebene und die Erstellung einer Weltdatenbank zur Spätfäule im Rahmen des Eucablight-Projekts (www.eucablight.org), einschließlich Mit den Ergebnissen der Mikrosatellitenanalyse konnten die Entstehung und Verbreitung neuer Genotypen auf der ganzen Welt verfolgt werden.
Amplifizierter Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (AFLP). AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ist eine Technologie zur Erzeugung zufälliger molekularer Marker unter Verwendung spezifischer Primer. Bei AFLP wird DNA mit einer Kombination von zwei Restriktionsenzymen behandelt. Spezifische Adapter werden an die klebrigen Enden der Restriktionsfragmente ligiert.
Diese Fragmente werden dann unter Verwendung von Primern amplifiziert, die zur Adaptersequenz und Restriktionsstelle komplementär sind und zusätzlich eine oder mehrere zufällige Basen an ihren 3'-Enden tragen. Der Satz der erhaltenen Fragmente hängt von Restriktionsenzymen und zufällig ausgewählten Nukleotiden an den 3'-Enden der Primer ab (Vos et al., 1995). AFLP - Genotypisierung wird verwendet, um die genetische Variation verschiedener Organismen schnell zu untersuchen.
Eine detaillierte Beschreibung der Methode findet sich in den Arbeiten von Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul et al., 1999. Viele Arbeiten zum Vergleich der Auflösung von AFLP- und SSR-Methoden wurden von chinesischen Forschern durchgeführt. Die phänotypischen und genotypischen Eigenschaften von 48 P. infestans-Isolaten, die in fünf Regionen Nordchinas gesammelt wurden, wurden untersucht. Die AFLP-Spektren zeigten im Gegensatz zu den SSR-Genotypen, für die keine Diversität gefunden wurde, acht verschiedene DNA-Genotypen (Guo et al., 2008).
Amplifikation mit Primern, die homolog zu den Sequenzen mobiler Elemente sind
Marker, die von Sequenzen von Retrotransposons abgeleitet sind, sind sehr praktisch für die genetische Kartierung, die Untersuchung der genetischen Vielfalt und der Evolutionsprozesse (Schulman, 2006). Wenn Primer hergestellt werden, um die stabilen Sequenzen bestimmter mobiler Elemente zu ergänzen, ist es möglich, die zwischen ihnen befindlichen Genomregionen zu amplifizieren. In Studien zum Erreger der Spätfäule wurde die Methode zur Amplifikation von Genomregionen unter Verwendung eines Primers, der zur Kernsequenz des SINE-Retroazons (Short Interspersed Nuclear Elements) komplementär ist, erfolgreich eingesetzt (Lavrova und Elansky, 2003). Mit dieser Methode wurden Unterschiede auch bei den asexuellen Nachkommen eines Isolats festgestellt. In diesem Zusammenhang wurde der Schluss gezogen, dass die Inter-SINE-PCR-Methode hochspezifisch ist und die Bewegungsrate der SINE-Elemente im Phytophthora-Genom hoch ist.
Im Genom von P. infestans wurden 12 Familien von kurzen Retrotransposons (SINEs) identifiziert; Die Artenverteilung von kurzen Retrotransposons wurde untersucht, Elemente (SINEs) wurden identifiziert, die nur im Genom von P. infestans gefunden werden (Lavrova, 2004).
Merkmale der Anwendung von Methoden zur vergleichenden Untersuchung von Stämmen in Populationsstudien
Bei der Planung einer Studie ist es erforderlich, die verfolgten Ziele klar zu verstehen und die entsprechenden Methoden anzuwenden. Daher ermöglichen einige Verfahren die Erzeugung einer großen Anzahl unabhängiger Markermerkmale, weisen jedoch gleichzeitig eine geringe Reproduzierbarkeit auf und hängen stark von den verwendeten Reagenzien, den Reaktionsbedingungen und der Kontamination des untersuchten Materials ab. Daher ist es bei jeder Untersuchung einer Gruppe von Stämmen erforderlich, mehrere Standard- (Referenz-) Isolate zu verwenden, aber selbst in diesem Fall sind die Ergebnisse mehrerer Experimente sehr schwer zu kombinieren.
Diese Gruppe von Methoden umfasst RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Nach der Amplifikation wird eine große Anzahl von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe erhalten. Es ist ratsam, solche Techniken anzuwenden, wenn Unterschiede zwischen eng verwandten Stämmen (Elternnachkommen, Wildtyp-Mutanten usw.) festgestellt werden müssen oder wenn eine detaillierte Analyse einer kleinen Probe erforderlich ist. Daher wird die AFLP-Methode häufig bei der genetischen Kartierung von P. infestans (van der Lee et al., 1997) und in Intrapopulationsstudien (Knapova, Gisi, 2002, Cooke et al., 2003, Flier et al., 2003) verwendet. Solche Methoden sind beim Erstellen von Stammdatenbanken unpraktisch, da Es ist praktisch unmöglich, die Bilanzierung der Ergebnisse zu vereinheitlichen, wenn Analysen in verschiedenen Labors durchgeführt werden.
Trotz der scheinbaren Einfachheit und Geschwindigkeit der Ausführung (DNA-Isolierung ohne gute Reinigung, Amplifikation, Visualisierung der Ergebnisse) erfordert diese Gruppe von Methoden die Verwendung einer speziellen Methode zur Dokumentation der Ergebnisse: Destillation in Polyacrylamidgel mit markierten (radioaktiven oder lumineszierenden) Primern und anschließende Beleuchtung von Licht oder radioaktivem Material. Herkömmliche Ethidiumbromid-Agarose-Gel-Bildgebung ist für diese Verfahren im Allgemeinen nicht geeignet, weil Eine große Anzahl von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe kann fusionieren.
Andere Methoden ermöglichen es im Gegenteil, eine kleine Anzahl von Merkmalen mit ihrer sehr hohen Reproduzierbarkeit zu erzeugen. Diese Gruppe umfasst die Untersuchung mitochondrialer DNA-Haplotypen (in Russland sind nur zwei Haplotypen Ia und IIa bekannt), des Paarungstyps (die meisten Isolate sind in zwei Typen unterteilt: A2 und A1, selbstfruchtbares SF wird selten gefunden) und der Peptidase-Isozymspektren (zwei Loci Pep2 und Pep1) , bestehend aus jeweils zwei Isozymen) und Glucose-2-phosphat-Isomerase (in Russland gibt es keine Variabilität in diesem Merkmal, obwohl in anderen Ländern der Welt ein signifikanter Polymorphismus festgestellt wird). Es ist ratsam, diese Funktionen bei der Analyse von Sammlungen und der Erstellung regionaler und globaler Datenbanken zu verwenden. Bei der Analyse von Isozymen und Haplotypen mitochondrialer DNA kann überhaupt auf Standardstämme verzichtet werden, während bei der Analyse von Paarungstypen zwei Testisolate mit bekannten Paarungstypen erforderlich sind.
Reaktionsbedingungen und Reagenzien können nur den Kontrast des Produkts im Elektrophoretogramm beeinflussen, die Manifestation von Artefakten in solchen Studien ist unwahrscheinlich.
Gegenwärtig ist die Mehrheit der Populationen im europäischen Teil Russlands durch Stämme beider Paarungstypen vertreten (Tabelle 6), darunter Isolate mit den Typen Ia und IIa mitochondrialer DNA (andere Arten von mtDNA, die auf der Welt gefunden wurden, wurden in Russland nach 1993 nicht mehr gefunden). Die Spektren von Peptidase-Isozymen werden durch zwei Genotypen am Pep1-Locus (100/100, 92/92 und heterozygote 92/100, und der Genotyp 92/92 ist äußerst selten (<0,3%)) und durch zwei Genotypen am Pep 2-Locus (100/100) dargestellt , 112/112 und heterozygote 100/112, wobei der Genotyp 112/112 weniger häufig als 100/100, aber auch ziemlich häufig auftritt).
Es gab keine Variabilität im Spektrum der Isoenzyme der Glucose-6-phosphat-Isomerase nach 1993 (das Verschwinden der klonalen Linie US-1), alle untersuchten Isolate hatten den Genotyp 100/100 (Elansky und Smirnov, 2002).
Die dritte Gruppe von Methoden ermöglicht es, eine ausreichende Gruppe unabhängiger Markerzeichen mit hoher Reproduzierbarkeit zu erhalten. Zu dieser Gruppe gehört heute die RFLP-RG57-Sonde, die 25 bis 29 DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe produziert. RFLP-RG57 kann sowohl beim Analysieren von Proben als auch beim Kompilieren von Datenbanken verwendet werden. Dieses Verfahren ist jedoch viel teurer als die vorherigen, es ist zeitaufwendig und erfordert eine ausreichend große Menge hochgereinigter DNA. Daher ist der Forscher gezwungen, das Volumen des getesteten Materials zu begrenzen.
Die Entwicklung von RFLP-RG57 in den frühen 90er Jahren des letzten Jahrhunderts hat die Populationsstudien zum Erreger der Spätfäule erheblich intensiviert. Es wurde zur Grundlage der Methode, die auf der Auswahl und Analyse von "klonalen Linien" beruhte (siehe unten). Zusammen mit RFLP-RG57 werden der Paarungstyp, das DNA-Fingerprinting (RFLP-RG57-Verfahren), Peptidase- und Glucose-6-Phosphat-Isomerase-Isozymspektren und der mitochondriale DNA-Typ verwendet, um klonale Linien zu identifizieren. Dank ihm wurde gezeigt, al., 1994), der Ersatz alter Populationen durch neue (Drenth et al., 1993, Sujkowski et al., 1994, Goodwin et al., 1995a) und klonale Abstammungslinien, die in vielen Ländern der Welt vorherrschen. Studien an russischen Stämmen unter Verwendung dieser Methode zeigten einen hohen genotypischen Polymorphismus der Stämme des europäischen Teils und einen Monomorphismus der Populationen der asiatischen und fernöstlichen Teile Russlands (Elansky et al., 2001). Und jetzt bleibt diese Methode die wichtigste in Populationsstudien von P. infestans. Seine weite Verbreitung wird jedoch durch seine relativ hohen Kosten und Arbeitsintensität bei der Ausführung behindert.
Die Mikrosatelliten-Wiederholungsanalyse (SSR) ist eine weitere vielversprechende Technik, die in P. infestans-Studien selten angewendet wird. Gegenwärtig wird diese Methode häufig verwendet, um klonale Linien zu isolieren. Für die Analyse von Stämmen wurden phänotypische Markermerkmale wie das Vorhandensein von Virulenzgenen für Kartoffelsorten (Avdey, 1995, Ivanyuk et al., 2002, Ulanova et al., 2003) und Tomaten weit verbreitet verwendet (und werden weiterhin verwendet). Inzwischen haben Virulenzgene für Kartoffelsorten ihren Wert als Markermerkmale für Populationsstudien verloren, da in der überwiegenden Mehrheit der Isolate die maximale (oder nahezu) Anzahl von Virulenzgenen auftritt. Gleichzeitig wird das T1-Virulenzgen für Tomatensorten, die das entsprechende Ph1-Gen tragen, immer noch erfolgreich als Markermerkmal verwendet (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al., 2003).
In vielen Arbeiten wird die Resistenz gegen Fungizide als Markermerkmal verwendet. Dieses Merkmal ist in Populationsstudien aufgrund des relativ leichten Auftretens von Resistenzmutationen in klonalen Linien nach der Anwendung von Metalaxyl- (oder Mefenoxam-) enthaltenden Fungiziden auf dem Feld unerwünscht. Beispielsweise wurden signifikante Unterschiede im Resistenzniveau innerhalb der klonalen Sib1-Linie gezeigt (Elansky et al., 2001).
Daher sind der Paarungstyp, das Peptidase-Isozymspektrum, der mitochondriale DNA-Typ, RFLP-RG57 und SSR bevorzugte Marker für die Erstellung von Datenbanken und die Markierung von Stämmen in Sammlungen. Um begrenzte Proben zu vergleichen, können Sie AFLP-, RAPD-, InterSSR- und Inter-SINE-PCR verwenden, wenn die maximale Anzahl von Markermerkmalen verwendet werden muss (Tabelle 5). Es sollte jedoch beachtet werden, dass diese Methoden schlecht reproduzierbar sind und in jedem einzelnen Experiment (Amplifikationselektrophoresezyklus) mehrere Referenzisolate verwendet werden müssen.
Tabelle 5. Vergleich verschiedener Methoden zur Untersuchung von Stämmen P. infestans
Kriterium | TC | Isofer Polizisten | MtDNA | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | Umdrehung |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Menge an Informationen | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Reproduzierbarkeit | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Möglichkeit von Artefakten | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Kosten | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Arbeitsintensität | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Analysegeschwindigkeit ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Anmerkung: H - niedrig, C - mittel, B - hoch; НС * - Die Arbeitsintensität ist bei Verwendung von Agarosegel oder automatisch gering
Genotyper, mittel - durch Destillation in Polyacrylamidgel mit markierten Primern,
** - ohne die Zeit, die für das Wachstum des Myzels zur DNA-Isolierung aufgewendet wurde.
Bevölkerungsstruktur
Klonale Linien
In Ermangelung einer Rekombination oder ihres unbedeutenden Beitrags zur Populationsstruktur besteht die Population aus einer bestimmten Anzahl von Klonen, deren genetischer Austausch äußerst selten ist.
In solchen Populationen ist es informativer, nicht die Häufigkeit einzelner Gene zu untersuchen, sondern die Häufigkeit von Genotypen, die einen gemeinsamen Ursprung haben (klonale Linien oder klonale Linien) und sich nur in Punktmutationen unterscheiden. Populationsstudien zum Spätbrandpathogen und zur Analyse klonaler Linien haben sich seit dem Aufkommen der RFLP-RG57-Methode in den frühen 90er Jahren des letzten Jahrhunderts erheblich beschleunigt. Zusammen mit RFLP-RG57 werden der Paarungstyp, Spektren von Peptidase- und Glucose-6-Phosphat-Isomerase-Isoenzymen und der mitochondriale DNA-Typ verwendet, um klonale Linien zu identifizieren. Die Eigenschaften der häufigsten klonalen Linien sind in Tabelle 6 gezeigt.
Der Klon US-1 dominierte die Populationen bis Ende der 80er Jahre überall. Danach wurde er durch andere Klone ersetzt und verschwand aus Europa und Nordamerika. Es ist jetzt im Fernen Osten (Philippinen, Taiwan, China, Japan, Korea, Koh et al., 1994, Mosa et al., 1993), in Afrika (Uganda, Kenia, Ruanda, Goodwin et al., 1994, Vega-Sanchez et al.) Zu finden al., 2000; Ochwo et al., 2002) und in Südamerika (Ecuador, Brasilien, Peru, Forbes et al., 1997, Goodwin et al., 1994). Allein in Australien wurden keine Stämme der US-1-Linie identifiziert. Anscheinend kamen P. infestans-Isolate mit einer weiteren Migrationswelle nach Australien (Goodwin, 1997).
Der Klon US-6 wanderte Ende der 70er Jahre von Nordmexiko nach Kalifornien aus und verursachte nach 32 Jahren ohne Krankheit eine Epidemie bei Kartoffeln und Tomaten. Aufgrund seiner hohen Aggressivität verdrängte es den US-1-Klon und begann, die Westküste der Vereinigten Staaten zu dominieren (Goodwin et al., 1995a).
Die Genotypen US-7 und US-8 wurden 1992 in den USA entdeckt und waren bereits 1994 in den USA und Kanada weit verbreitet. Während einer Feldsaison kann der Klon US-8 den Klon US-1 in Kartoffelparzellen, die anfänglich mit beiden Klonen in gleicher Konzentration infiziert waren, fast vollständig verdrängen (Miller und Johnson, 2000).
Die Klone BC-1 bis BC-4 wurden in British Columbia in einer kleinen Anzahl von Isolaten von Goodwin et al., 1995b) identifiziert. Der Klon US-11 verbreitete sich weit in den USA und verdrängte US-1 in Taiwan. Die Klone JP-1 und EC-1 sind zusammen mit dem Klon US-1 in Japan bzw. Ecuador üblich (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 ist ein Klon, der sich in Russland über ein weites Gebiet von der Moskauer Region bis nach Sachalin durchgesetzt hat. In der Region Moskau wurde es 1993 entdeckt, und einige Feldpopulationen bestanden hauptsächlich aus Stämmen dieser klonalen Linie, die gegen Metalaxyl hochresistent waren. Nach 1993 nahm die Prävalenz dieses Klons signifikant ab. Außerhalb des Urals wurde SIB-1997 1998-1 überall gefunden, mit Ausnahme des Chabarowsk-Territoriums (der Klon SIB-2 ist dort weit verbreitet). Die räumliche Trennung von Klonen mit unterschiedlichen Paarungsarten schließt den sexuellen Prozess in Sibirien und Fernost aus. In der Region Moskau ist die Bevölkerung im Gegensatz zu Sibirien durch viele Klone vertreten; Fast jedes Isolat hat einen einzigartigen Multilocus-Genotyp (Elansky et al., 2001, 2015). Diese Vielfalt kann nicht allein durch den Import von Pilzstämmen aus verschiedenen Teilen der Welt mit importiertem Saatgut erklärt werden. Da beide Arten der Paarung in der Population auftreten, ist es möglich, dass ihre Diversität auch auf Rekombination zurückzuführen ist. Daher wird in British Columbia das Auftreten der Genotypen BC-2, BC-3 und BC-4 aufgrund der Hybridisierung der Klone BC-1 und US-6 angenommen (Goodwin et al., 1995b). Es ist möglich, dass Hybridstämme in Moskauer Populationen gefunden werden. Beispielsweise können die für den PEP-Locus heterozygoten Stämme MO-4, MO-8 und MO-11 Hybride zwischen den Stämmen MO-12, MO-21, MO-22 sein, die den Paarungstyp A2 aufweisen und für ein Allel des PEP-Locus und den Stamm homozygot sind MO-8 mit dem Paarungstyp A1 und homozygot für das andere Allel des Locus. Wenn dies der Fall ist und in modernen Populationen von P. infestans die Rolle des sexuellen Prozesses tendenziell zunimmt, nimmt der Informationswert der Analyse von Multilocus-Klonen ab (Elansky et al., 2001, 2015).
Variation in klonalen Linien
Bis in die 90er Jahre des 20. Jahrhunderts war die klonale Linie US-1 in der Welt weit verbreitet. Die meisten Feld- und Regionalpopulationen bestanden ausschließlich aus Stämmen mit dem US-1-Genotyp. Es wurden jedoch auch Unterschiede zwischen Isolaten beobachtet, die höchstwahrscheinlich durch einen Mutationsprozess verursacht wurden. Mutationen traten sowohl in der nuklearen als auch in der mitochondrialen DNA auf und beeinflussten unter anderem das Ausmaß der Resistenz gegen Phenylamid-Medikamente und die Anzahl der Virulenzgene. Linien, die sich durch Mutationen von den ursprünglichen Genotypen unterscheiden, werden durch zusätzliche Zahlen nach dem Punkt nach dem Namen des ursprünglichen Genotyps angezeigt (z. B. die US-1.1-Mutantenlinie der klonalen Linie US-1). Fingerabdruck-DNA-Linien US-1.5 und US-1.6 enthalten akzessorische Linien unterschiedlicher Größe (Goodwin et al., 1995a, 1995b); Die klonale Linie US-6.3 unterscheidet sich auch von US-6 in einer zusätzlichen Linie (Goodwin, 1997, Tabelle 7).
Bei der Untersuchung der mitochondrialen DNA wurde festgestellt, dass in der klonalen Linie US-1 nur mitochondriale DNA vom Typ 1b gefunden wird (Carter et al., 1990). Bei der Untersuchung von Stämmen dieser klonalen Linie aus Peru und den Philippinen wurden jedoch Isolate gefunden, deren mitochondriale DNA-Typen sich in Gegenwart von Insertionen und Deletionen von 1b unterschieden (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994).
Tabelle 6. Multilocus-Genotypen einiger klonaler Linien von P. infestans
Name | Paarungstyp | Isozyme | DNA-Fingerabdrücke | MtDNA-Typ | |
GPI | PEP | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011E + 24 | Ib |
US-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011E + 24 | - |
US-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011E + 24 | IIb |
US-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
US-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
US-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIb |
US-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | - |
US-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011E + 24 | - |
US-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011E + 24 | - |
US-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011E + 24 | - |
US-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
EC-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011E + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011E + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011E + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011E + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011E + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011E + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011E + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011E + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011E + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011E + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011E + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
Hinweis: * - keine Daten.
Tabelle 7. Multilocus-Genotypen und ihre Mutantenlinien
Name | Paarungstyp | | DNA-Fingerabdrücke (RG57) | Aufzeichnungen | |
GPI | PEP-1 | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Ursprünglicher Genotyp 1 |
US-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutation in PEP |
US-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutation in RG57 |
US-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutation in RG57 |
US-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutation in RG57 und PEP |
US-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutation in RG57 |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Ursprünglicher Genotyp 2 |
US-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutation in PEP |
US-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutation in RG57 |
US-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutation in RG57 |
US-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutation in RG57 und PEP |
US-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutation in RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Ursprünglicher Genotyp 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutation in RG57 |
Es gibt auch Änderungen in den Spektren von Isozymen. Sie werden in der Regel durch den Abbau eines für dieses Enzym zunächst heterozygoten Organismus in homozygote Organismen verursacht. 1993 identifizierten wir an Tomatenfrüchten einen Stamm mit für US-1 typischen Merkmalen: RG57-Fingerabdruck, mitochondrialer DNA-Typ und 86/100-Genotyp für Glucose-6-phosphatizomerase, der jedoch für den ersten Peptidase-Locus homozygot (100/100) war eine 92/100 Heterozygote, die typisch für diese klonale Linie ist. Wir haben den Genotyp dieses Stammes MO-17 genannt (Tabelle 6). Die Mutantenlinien US-1.1 und US-1.4 unterscheiden sich von US-1 auch durch Mutationen am ersten Peptidase-Locus (Tabelle 7).
Mutationen, die zu Veränderungen in der Anzahl der Virulenzgene für Kartoffel- und Tomatensorten führen, sind recht häufig. Sie wurden unter Isolaten der Klonlinie US-1 in Populationen aus den Niederlanden (Drenth et al., 1994), Peru (Goodwin et al., 1995a), Polen (Sujkowski et al., 1991), Nordamerika (Goodwin et al., ., 1995b). Unterschiede in der Anzahl der Kartoffelvirulenzgene wurden auch bei Isolaten der klonalen Linien US-7 und US-8 in Kanada und den Vereinigten Staaten (Goodwin et al., 1995a) sowie bei Isolaten der SIB-1-Linie im asiatischen Teil Russlands festgestellt (Elansky et al., 2001) ).
Isolate mit starken Unterschieden in der Resistenz gegen Phenylamid-Arzneimittel wurden in monoklonalen Feldpopulationen identifiziert, die alle zur klonalen Linie Sib-1 gehörten (Elansky et al., 2001, Tabelle 1). Fast alle Stämme der klonalen Linie US-1 sind hochempfindlich gegenüber Metalaxyl, jedoch wurden hochresistente Isolate dieser Linie auf den Philippinen (Koh et al., 1994) und in Irland (Goodwin et al., 1996) isoliert.
Moderne Populationen von P. infestans
Mittelamerika (Mexiko)
Die Bevölkerung von P. infestans in Mexiko unterscheidet sich deutlich von anderen Weltbevölkerungen, was hauptsächlich auf ihre historische Position zurückzuführen ist. Zahlreiche Studien dieser Population und verwandter P. infestans-Arten der Klade Phytophthora sowie lokaler Arten der Gattung Solanum führten zu dem Schluss, dass die Entwicklung des Erregers im zentralen Teil Mexikos zusammen mit der Entwicklung der Wirtspflanzen stattfand und mit der sexuellen Rekombination verbunden war (Grünwald, Flier , 2005). Beide Arten der Paarung sind in der Population und zu gleichen Anteilen vertreten, und das Vorhandensein von Oosporen im Boden auf Pflanzen und Knollen von Kartoffeln und wild wachsenden verwandten Arten Solanum bestätigt das Vorhandensein eines sexuellen Prozesses in der Population (Fernández-Pavía et al., 2002). Jüngste Studien des Toluca-Tals und seiner Umgebung (das vermutliche Ursprungszentrum des Erregers) bestätigten die hohe genetische Vielfalt der lokalen Population von P. infestans (134 Multilocus-Genotypen in einer Stichprobe von 176 Proben) und das Vorhandensein mehrerer differenzierter Subpopulationen in der Region (Wang et al., 2017). Die Faktoren, die zu dieser Differenzierung beitragen, sind die räumliche Aufteilung der für das Hochland von Zentralmexiko charakteristischen Subpopulationen, Unterschiede in den Anbaubedingungen und Kartoffelsorten in Tälern und Bergen sowie das Vorhandensein wilder knollenartiger Solanum-Arten, die als alternative Wirte fungieren können (Fry et al ., 2009).
Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Populationen von P. infestans in Nordmexiko eher klonal sind und den nordamerikanischen Populationen ähnlicher sind, was darauf hindeuten könnte, dass dies die neuen Genotypen sind (Fry et al., 2009).
Nordamerika
Die nordamerikanischen Populationen von P. infestans hatten immer eine sehr einfache Struktur und ihr klonaler Charakter wurde lange vor der Verwendung der Mikrosatellitenanalyse festgestellt. Bis 1987 dominierte die klonale Linie US-1 in den USA und Kanada (Goodwin et al., 1995). Mitte der 70er Jahre, als Fungizide auf Metalaxylbasis auftraten, wurde dieser Klon durch andere, resistentere Genotypen ersetzt, die aus Mexiko migrierten (Goodwin et al., 1998). Bis Ende der 90er Jahre. Der US-8-Genotyp ersetzte den US-1-Genotyp in den USA vollständig und wurde zur dominanten klonalen Linie bei Kartoffeln (Fry et al., 2009; Fry et al., 2015). Bei Tomaten, die ständig mehrere klonale Linien enthielten, war die Situation anders, und ihre Zusammensetzung änderte sich von Jahr zu Jahr (Fry et al., 2009).
Im Jahr 2009 brach in den USA eine groß angelegte Epidemie der Spätfäule bei Tomaten aus. Ein Merkmal dieser Pandemie war ihr fast gleichzeitiger Ausbruch an vielen Orten im Nordosten der Vereinigten Staaten, und es stellte sich heraus, dass sie mit massiven Verkäufen infizierter Tomatensämlinge in großen Gartencentern verbunden war (Fry et al., 2013). Die Ernteverluste waren enorm. Die Mikrosatellitenanalyse der betroffenen Proben ergab, dass der Pandemiestamm zur Paarung vom Typ US-22 A2 der klonalen Linie gehörte. Im Jahr 2009 erreichte der Anteil dieses Genotyps an der amerikanischen Bevölkerung von P. infestans 80% (Fry et al., 2013). In den Folgejahren stieg der Anteil der aggressiven Genotypen US-23 (hauptsächlich bei Tomaten) und US-24 (bei Kartoffeln) in der Bevölkerung stetig an. Nach 2011 nahm die Erkennungsrate von US-24 jedoch signifikant ab und bis heute etwa 90% der Erregerpopulation in Die Vereinigten Staaten werden durch den US-23-Genotyp repräsentiert (Fry et al., 2015).
In Kanada wie in den USA Ende der 90er Jahre. Der dominante Genotyp US-1 wurde durch US-8 ersetzt, dessen dominante Position bis 2008 unverändert blieb. In Kanada gab es schwere Spätbrand-Epidemien im Zusammenhang mit dem Verkauf infizierter Tomatensämlinge, die jedoch durch die Genotypen US-2009 und US-2010 verursacht wurden (Kalischuk et al., 23). Die klare geografische Differenzierung dieser Genotypen war bemerkenswert: US-8 dominierte die westlichen Provinzen Kanadas (2012%), während US-23 die östlichen Provinzen dominierte (68%). In den folgenden Jahren breitete sich US-8 in den östlichen Regionen aus, im Allgemeinen nahm sein Anteil an der Bevölkerung jedoch vor dem Hintergrund des Auftretens der Genotypen US-83 und US-23 im Land leicht ab (Peters et al., 22). Bis heute hat US-24 in ganz Kanada eine beherrschende Stellung. US-2014 ist in British Columbia vertreten, während US-23 und US-8 in Ontario vertreten sind (Peters, 23).
Somit sind die nordamerikanischen Populationen von P. infestans hauptsächlich klonale Linien. In den letzten 40 Jahren hat die Anzahl der nachgewiesenen klonalen Genotypen 24 erreicht. Trotz der Tatsache, dass Stämme beider Paarungstypen in der Population vorhanden sind, bleibt die Wahrscheinlichkeit des Auftretens neuer Genotypen infolge sexueller Rekombination recht gering. Trotzdem wurden in den letzten 20 Jahren mehrere Fälle des Auftretens kurzlebiger rekombinanter Populationen registriert (Gavino et al., 2000; Danies et al., 2014; Peters et al., 2014), und in einem Fall war das Ergebnis der Kreuzung der Genotyp US-11 , das viele Jahre in Nordamerika verankert war (Gavino et al., 2000). Bis 2009 waren Veränderungen in der Bevölkerungsstruktur mit der Entstehung neuer, aggressiverer Genotypen verbunden, die anschließend migrierten und frühere dominante Vorgänger verdrängten. Was ist 2009-2010 passiert? In den USA und Kanada zeigten Epiphytotika erstmals, dass im Zeitalter der Globalisierung Ausbrüche der Krankheit mit der aktiven Verbreitung neuer Genotypen beim Verkauf von infiziertem Pflanzenmaterial verbunden sein können.
Südamerika
Bis vor kurzem waren Studien an südamerikanischen Populationen von P. infestans weder regelmäßig noch groß angelegt. Es ist bekannt, dass die Struktur dieser Populationen recht einfach ist und 1-5 klonale Linien pro Land umfasst (Forbes et al., 1998). So wurden 1998 die Genotypen US-1 (Brasilien, Chile) BR-1 (Brasilien, Bolivien, Uruguay, Paraguay), EC-1 (Ecuador, Kolumbien, Peru und Venezuela), AR-1, AR auf Kartoffeln gefunden -2, AR-3, AR-4 und AR-5 (Argentinien), PE-3 und PE-7 (Südperu). Der Paarungstyp A2 war in Brasilien, Bolivien und Argentinien vorhanden und wurde nicht jenseits der bolivianisch-peruanischen Grenze im Gebiet des Titicacasees gefunden, hinter dem der Genotyp EC-1 A1 in den Anden dominierte. Bei Tomaten blieb US-1 der dominierende Genotyp in ganz Südamerika.
Die Situation hielt in den 2000er Jahren mehr oder weniger an. Ein wichtiger Punkt war die Entdeckung einer neuen klonalen Linie EC-2 vom Typ A2 in den nördlichen Anden an den wild wachsenden Kartoffelverwandten (S. brevifolium und S. tetrapetalum) (Oliva et al., 2010). Phylogenetische Studien haben gezeigt, dass diese Linie nicht vollständig mit P. infestans identisch ist, obwohl sie eng mit ihr verwandt ist, in Verbindung mit der sie in Betracht gezogen wurde, sowie mit einer anderen Linie, EC-3, die aus dem in den Anden wachsenden Tomatenbaum S. betaceum isoliert wurde. eine neue Art namens P. andina; Der Status dieser Art (eine unabhängige Art oder eine Hybride von P. infestans mit einer noch unbekannten Linie) ist jedoch noch unklar (Delgado et al., 2013).
Derzeit sind alle südamerikanischen Populationen von P. infestans klonal. Trotz des Vorhandenseins beider Paarungstypen wurden keine rekombinanten Populationen identifiziert. Bei Tomaten ist der US-1-Genotyp allgegenwärtig und wird offenbar von lokalen Stämmen aus Kartoffeln verdrängt, deren genaue Herkunft noch unbekannt ist. In Brasilien, Bolivien und Uruguay ist der BR-1-Genotyp vorhanden; In Peru gibt es neben US-1 und EC-1 mehrere andere lokale Genotypen. In den Anden bleibt die beherrschende Stellung durch die Klonlinie EC-1 erhalten, deren Beziehung zu dem kürzlich entdeckten P. andina noch unerforscht ist. Der einzige "instabile" Ort, an dem für den Zeitraum 2003-2013. Es gab signifikante Veränderungen in der Bevölkerung, wurde Chile (Acuña et al., 2012), wo in 2004-2005. Die Pathogenpopulation wurde durch Resistenz gegen Metalaxyl und einen neuen mitochondrialen DNA-Haplotyp (Ia anstelle des zuvor vorhandenen Ib) charakterisiert. 2006 bis 2011 In der Bevölkerung dominierte der Genotyp 21 (laut SSR), dessen Anteil 90% erreichte, wonach die Palme auf den Genotyp 20 überging, dessen Häufigkeit in den nächsten zwei Jahren bei etwa 67% gehalten wurde (Acuña, 2015).
Europa
In der Geschichte Europas gab es mindestens zwei Migrationswellen von P. infestans aus Nordamerika: im 1. Jahrhundert. (HERB-1) und frühes 70. Jahrhundert (US-1). Die allgegenwärtige Verbreitung von Metalaxyl-haltigen Fungiziden in den XNUMXer Jahren. führte zur Verdrängung des dominanten Genotyps US-XNUMX und dessen Ersatz durch neue Genotypen. Infolgedessen waren in den meisten westeuropäischen Ländern die Populationen des Erregers hauptsächlich durch mehrere klonale Linien vertreten.
Die Verwendung der Mikrosatellitenanalyse zur Analyse von Pathogenpopulationen ermöglichte es, schwerwiegende Veränderungen in Westeuropa in den Jahren 2005-2008 aufzudecken. 2005 wurde in Großbritannien eine neue klonale Linie namens 13_A2 (oder „Blue 13“) entdeckt, die durch den Paarungstyp A2 gekennzeichnet ist , hohe Aggressivität und Resistenz gegen Phenylamide (Shaw et al., 2007). Der gleiche Genotyp wurde in Proben gefunden, die 2004 in den Niederlanden und Nordfrankreich gesammelt wurden, was darauf hindeutete, dass er von Kontinentaleuropa nach Großbritannien migrierte, möglicherweise mit Pflanzkartoffeln (Cooke et al., 2007). Die Untersuchung des Genoms von Vertretern dieser klonalen Linie zeigte einen hohen Grad an Polymorphismus ihrer Sequenz (bis 2016 erreichte die Anzahl ihrer subklonalen Variationen 340) und einen signifikanten Grad an Variation im Grad der Genexpression, einschließlich. Effektorgene während einer Pflanzeninfektion (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017). Diese Merkmale könnten zusammen mit der verlängerten Dauer der biotrophen Phase eine erhöhte Aggressivität von 13_A2 und seine Fähigkeit verursachen, selbst Kartoffelsorten zu infizieren, die gegen Spätfäule resistent sind.
In den nächsten Jahren verbreitete sich der Genotyp schnell in den Ländern Nordwesteuropas (Großbritannien, Irland, Frankreich, Belgien, Niederlande, Deutschland), wobei gleichzeitig die zuvor dominanten Genotypen 1_A1, 2_A1, 8_A1 verdrängt wurden (Montarry et al., 2010; Gisi et al. , 2011; Van den Bosch et al., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Laut der Website www.euroblight.net erreichte der Anteil von 13_A2 an der Bevölkerung dieser Länder 60-80% und mehr; Das Vorhandensein dieses Genotyps wurde auch in einigen Ländern Ost- und Südeuropas nachgewiesen. Allerdings in 2009-2012. 13_A2 verlor seine beherrschende Stellung in Großbritannien und Frankreich und gab der Linie 6_A1 nach (8_A1 in Irland). In den Niederlanden und Belgien wurde es teilweise durch die Genotypen 1_A1, 6_A1 und 33_A2 ersetzt (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Bis heute sind etwa 70% der westeuropäischen Bevölkerung von P. infestans monoklonal. Laut der Website www.euroblight.net sind die dominierenden Genotypen in den Ländern Nordwesteuropas (Großbritannien, Frankreich,
Niederlande, Belgien) verbleiben ungefähr zu gleichen Teilen bei 13_A2 und 6_A1, und letzteres tritt praktisch nicht außerhalb der angegebenen Region auf (mit Ausnahme von Irland), hat jedoch bereits mindestens 58 Subklone (Cooke, 2017). Die Variationen 13_A2 sind in Deutschland in bemerkenswerter Anzahl vorhanden und werden auch in den Ländern Mittel- und Südeuropas sporadisch beobachtet. Der Genotyp 1_A1 macht einen bedeutenden Teil der belgischen und teilweise der niederländischen und französischen Bevölkerung aus. Der Genotyp 8_A1 hat sich in der europäischen Bevölkerung auf einem Niveau von 3-6% stabilisiert, mit Ausnahme von Irland, wo er seine führende Position behält und in zwei Subklone unterteilt ist (Stellingwerf, 2017). Schließlich wurde 2016 ein Anstieg der Häufigkeit des Auftretens neuer Genotypen 36_A2 und 37_A2 festgestellt, die erstmals in den Jahren 2013 bis 2014 verzeichnet wurden. Bisher sind diese Genotypen in den Niederlanden und in Belgien und teilweise in Frankreich und Deutschland sowie im südlichen Teil Großbritanniens zu finden (Cooke, 2017). Ungefähr 20-30% der westeuropäischen Bevölkerung sind jedes Jahr durch einzigartige Genotypen vertreten.
Im Gegensatz zu Westeuropa waren die Populationen Nordeuropas (Schweden, Norwegen, Dänemark, Finnland) zum Zeitpunkt des Auftretens des 13_A2-Genotyps nicht durch klonale Linien, sondern durch eine große Anzahl einzigartiger Genotypen vertreten (Brurberg et al.,
2011). Während der aktiven Ausbreitung von 13_A2 in Westeuropa wurde das Vorhandensein dieses Genotyps in Skandinavien erst 2011 festgestellt, als er erstmals in Nordjütland (Dänemark) entdeckt wurde, wo hauptsächlich industrielle Kartoffelsorten unter aktiver Verwendung von Metalaxyl-haltigen Pflanzen angebaut werden Fungizide (Nielsen et al., 2014). Laut www.euroblight.net wurde der Genotyp 13_A2 2014 auch in mehreren Proben aus Norwegen und Dänemark und 2016 in mehreren norwegischen Proben nachgewiesen. Darüber hinaus wurde 2013 in Finnland das Vorhandensein des Genotyps 6_A1 in geringer Menge festgestellt. Der Hauptgrund für das Scheitern von 13_A2 und anderen klonalen Linien bei der Eroberung Skandinaviens sind die klimatischen Unterschiede dieser Region zu den Ländern Westeuropas.
Neben der Tatsache, dass kühle Sommer und kalte Winter eher zum Überleben von Oosporen als von vegetativem Myzel beitragen (Sjöholm et al., 2013), trägt das Einfrieren des Bodens im Winter (das in wärmeren Ländern Westeuropas normalerweise nicht auftritt) zur Synchronisation der Keimung und Pflanzung von Oosporen bei. Kartoffel, die ihre Rolle als Quelle einer Primärinfektion verstärkt (Brurberg et al., 2011). Es sollte auch beachtet werden, dass unter nördlichen Bedingungen die Entwicklung einer Infektion durch Oosporen die Entwicklung einer tuberösen Infektion übersteigt, was letztendlich die Dominanz noch aggressiverer, aber später entwickelter klonaler Linien verhindert (Yuen, 2012). Die Struktur der am meisten untersuchten Populationen von P. infestans in Osteuropa (Polen, Baltikum) ist der in Skandinavien sehr ähnlich.
Beide Arten der Paarung sind auch hier vorhanden, und die überwiegende Mehrheit der durch SSR-Analyse bestimmten Genotypen ist einzigartig (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Wie in Nordeuropa wirkte sich die Ausbreitung klonaler Linien (hauptsächlich des Genotyps 13_A2) praktisch nicht auf die lokalen Populationen des Pathogens aus, die ein hohes Maß an Diversität beibehalten, wenn keine ausgeprägten dominanten Linien vorhanden sind.
Das Vorhandensein von 13_A2 wird gelegentlich auf Feldern mit kommerziellen Kartoffelsorten beobachtet. In Russland entwickelt sich die Situation ähnlich. Mikrosatellitenanalyse von P. infestans-Isolaten, die 2008-2011 gesammelt wurden zeigten in 10 verschiedenen Regionen des europäischen Teils Russlands ein hohes Maß an genotypischer Vielfalt und einen völligen Mangel an Übereinstimmungen mit europäischen klonalen Linien (Statsyuk et al., 2014). Einige Jahre später zeigte eine Studie mit P. infestans-Proben, die 2013-2014 in der Region Leningrad gesammelt wurden, signifikante Unterschiede zwischen ihnen und den in der vorherigen Studie identifizierten Genotypen aus dieser Region. In beiden Studien wurden keine westeuropäischen Genotypen gefunden (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2016).
Die hohe genetische Vielfalt der osteuropäischen Populationen von P. infestans und das Fehlen dominanter klonaler Linien in ihnen kann mehrere Gründe haben. Erstens tragen wie in Nordeuropa die klimatischen Bedingungen der betrachteten Länder zur Bildung von Oosporen als primäre Infektionsquelle bei (Ulanova et al., 2010; Chmielarz et al., 2014). Zweitens wird ein erheblicher Teil der in diesen Ländern produzierten Kartoffeln auf kleinen privaten Farmen angebaut, die häufig von Wäldern oder anderen Hindernissen für den freien Verkehr von infektiösem Material umgeben sind (Chmielarz et al., 2014). In der Regel werden unter solchen Bedingungen angebaute Kartoffeln praktisch nicht mit Chemikalien behandelt, und die Auswahl der Sorten basiert auf ihrer Beständigkeit gegen Spätbrand, d. H. Es gibt keinen selektiven Druck auf Aggressivität und Resistenz gegen Metalaxyl, wodurch resistente Genotypen wie 13_A2 Vorteile gegenüber anderen Genotypen verlieren (Chmielarz et al., 2014). Schließlich praktizieren ihre Eigentümer aufgrund der geringen Größe der Grundstücke in der Regel keine Fruchtfolge und bauen jahrelang Kartoffeln am selben Ort an, was zur Akkumulation eines genetisch vielfältigen Inokulums beiträgt (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
Asien
Bis vor kurzem war die Struktur der Populationen von P. infestans in Asien noch relativ wenig bekannt. Es war bekannt, dass es hauptsächlich durch klonale Linien dargestellt wird und der Effekt der sexuellen Rekombination auf die Entstehung neuer Genotypen sehr gering ist. So zum Beispiel 1997-1998. Im asiatischen Teil Russlands (Sibirien und Fernost) war die Pathogenpopulation nur durch drei Genotypen vertreten, wobei der SIB-1-Genotyp überwog (Elansky et al., 2001). Das Vorhandensein klonaler Pathogenlinien wurde in Ländern wie China, Japan, Korea, den Philippinen und Taiwan gezeigt (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). Die klonale Linie US-1, die Ende der 90er - Anfang der 2000er Jahre über ein großes Gebiet Asiens dominierte. Fast überall wurden sie durch andere Genotypen ersetzt, die wiederum neuen Platz machten. In den meisten Fällen waren Veränderungen in der Struktur und Zusammensetzung der Populationen in asiatischen Ländern mit der Migration neuer Genotypen von außen verbunden. In Japan haben mit Ausnahme des JP-3-Genotyps alle anderen japanischen Genotypen, die nach US-1 (JP-1, JP-2, JP-3) auftraten, einen mehr oder weniger nachgewiesenen externen Ursprung (Akino et al., 2011). ... In China gibt es derzeit drei Hauptpathogenpopulationen mit einer klaren geografischen Aufteilung; Es gibt keinen oder einen sehr schwachen Genfluss zwischen diesen Populationen (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). Der Genotyp 13_A2 erschien 2005-2007 und 2012-1014 auf dem Territorium Chinas in seinen südlichen Provinzen (Yunnan und Sichuan). wurde auch im Nordosten des Landes gesehen (Li et al., 2013b). In Indien trat 13_A2 vermutlich zur gleichen Zeit wie in China auf, höchstwahrscheinlich bei infizierten Pflanzkartoffeln (Chowdappa et al., 2015) und 2009-2010. verursachte eine schwere epiphytotische Krankheit der Spätfäule bei Tomaten im Süden des Landes, nach der sie sich auf Kartoffeln ausbreitete und 2014 in Westbengalen einen Ausbruch der Spätfäule verursachte, der zum Ruin und Selbstmord vieler lokaler Landwirte führte (Fry, 2016).
Afrika
Bis 2008-2010 Systematische Studien zu P. infestans in afrikanischen Ländern wurden nicht durchgeführt. Gegenwärtig kann die afrikanische Population von P. infestans in zwei Gruppen eingeteilt werden, und diese Unterteilung ist eindeutig mit der Tatsache verbunden, dass Pflanzkartoffeln aus Europa importiert werden.
In Nordafrika, das aktiv Pflanzkartoffeln aus Europa importiert, ist der Paarungstyp A2 in fast allen Regionen weit verbreitet, was die theoretische Möglichkeit bietet, dass durch sexuelle Rekombination neue Genotypen entstehen (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). Darüber hinaus wird in Algerien das Vorhandensein der Genotypen 13_A2, 2_A1 und 23_A1 mit einer ausgeprägten Dominanz des ersten von ihnen sowie einer allmählichen Abnahme des Anteils einzigartiger Genotypen bis zum vollständigen Verschwinden festgestellt (Rekad et al., 2017). Im Gegensatz zum Rest der Region ist in Tunesien (mit Ausnahme des Nordostens des Landes) die Erregerpopulation hauptsächlich durch den Paarungstyp A1 vertreten (Harbaoui et al., 2014).
Hier dominiert die klonale Linie NA-01. Im Allgemeinen beträgt der Anteil klonaler Linien an der Bevölkerung nur 43%. Im östlichen und südlichen Afrika, wo das Volumen der Samenimporte verschwindend gering ist (Fry et al., 2009), ist P. infestans nur durch zwei klonale Linien vom Typ A1 vertreten, US-1 und KE-1, und letztere verdrängen erstere aktiv auf Kartoffeln (Fr. Pule et al., 2012; Njoroge et al., 2016). Bisher weisen beide Genotypen eine bemerkenswerte Anzahl subklonaler Variationen auf.
Australien
Der erste Bericht über die Spätfäule bei Kartoffeln in Australien stammt aus dem Jahr 1907, und die erste Epiphytotie, die vermutlich durch starke Regenfälle in den Sommermonaten verursacht wurde, trat zwischen 1909 und 1911 auf. (Drenth et al., 2002). Im Allgemeinen hat die Spätfäule jedoch keine wesentliche wirtschaftliche Bedeutung für das Land. Sporadische Ausbrüche von Spätfäule, hervorgerufen durch Wetterbedingungen mit hoher Luftfeuchtigkeit, treten nicht häufiger als einmal alle 5-7 Jahre auf und sind hauptsächlich in Nord-Tasmanien und im Zentrum von Victoria lokalisiert. Im Zusammenhang mit dem oben Gesagten fehlen praktisch Veröffentlichungen, die sich mit der Untersuchung der Struktur der australischen Bevölkerung von P. infestans befassen. Die neuesten verfügbaren Informationen stammen aus den Jahren 1998-2000. (Drenth et al., 2002). Laut den Autoren war die Bevölkerung des Bundesstaates Victoria eine klonale Linie US-1.3, die indirekt die Migration dieses Genotyps aus den Vereinigten Staaten bestätigte. Die tasmanischen Exemplare wurden als AU-3 klassifiziert, anders als die Genotypen, die zu dieser Zeit in anderen Teilen der Welt vorhanden waren.
Merkmale der Entwicklung der Spätfäule in Russland
In Europa kam es zu einer Infektion mit erkrankten Samenknollen, im Boden überwinternden Oosporen sowie Zoosporangien, die vom Wind von Pflanzen stammen, die aus überwinternden Knollen auf den Feldern des letzten Jahres ("freiwillige" Pflanzen) oder auf Keulungshaufen gewachsen waren Lesezeichen für die Lagerung von Knollen. Von diesen gelten Pflanzen, die auf Haufen weggeworfener Knollen wachsen, als die gefährlichste Infektionsquelle. Dort ist die Anzahl der gekeimten Knollen oft signifikant, und Zoosporangien können über große Entfernungen von ihnen getragen werden. Der Rest der Quellen (Oosporen, "freiwillige" Pflanzen) ist nicht so gefährlich, weil Es ist nicht üblich, Pflanzen auf denselben Feldern öfter als einmal alle 3-4 Jahre zu züchten. Die Infektion durch erkrankte Samenknollen ist aufgrund eines guten Systems zur Kontrolle der Samenqualität ebenfalls minimal.
Im Allgemeinen ist die Menge an Inokulum in europäischen Populationen begrenzt, und daher ist der Anstieg der Epidemie eher langsam und kann mit chemischen fungiziden Präparaten erfolgreich kontrolliert werden. Die Hauptaufgabe unter europäischen Bedingungen ist der Kampf gegen Infektionen in der Phase, in der die Massenverbreitung von Zoosporangien aus betroffenen Pflanzen beginnt.
In Russland ist die Situation radikal anders. Der größte Teil der Kartoffel- und Tomatenernte wird in kleinen privaten Gärten angebaut. Schutzmaßnahmen werden entweder überhaupt nicht durchgeführt, oder es werden fungizide Behandlungen in unzureichender Anzahl durchgeführt und beginnen nach dem Auftreten einer späten Knollenfäule auf den Oberseiten. Infolgedessen sind private Gemüsegärten die Hauptinfektionsquelle, von der Zoosporangien vom Wind zu kommerziellen Pflanzungen transportiert werden. Dies wird durch unsere direkten Beobachtungen in den Regionen Moskau, Brjansk, Kostroma und Rjasan bestätigt: Schäden an Pflanzen in privaten Gärten werden bereits vor Beginn der Fungizidbehandlung von kommerziellen Pflanzungen beobachtet. In der Folge wird die Epidemie auf großen Feldern durch die Verwendung von fungiziden Präparaten gebremst, während in privaten Gärten eine rasche Entwicklung der Spätfäule auftritt.
Bei falschen oder "budgetären" Behandlungen von kommerziellen Pflanzungen treten auf den Feldern Spätbrandherde auf; später entwickeln sie sich aktiv und decken immer größere Gebiete ab (Elansky, 2015). Infektionen in privaten Gärten haben erhebliche Auswirkungen auf Epidemien in kommerziellen Bereichen. In allen Kartoffelanbaugebieten Russlands ist die Fläche, die Kartoffeln in privaten Gärten einnehmen, um ein Vielfaches größer als die Gesamtfläche der Felder großer Erzeuger. In einem solchen Umfeld können private Gemüsegärten als globale Inokulumressource für gewerbliche Bereiche angesehen werden. Versuchen wir, die Eigenschaften zu identifizieren, die für die Genotypen von Stämmen in privaten Gärten charakteristisch sind.
Das Anpflanzen von Kartoffeln ohne Samen und die Quarantänekontrolle von Warenkartoffeln, Tomatensamen von zweifelhaften ausländischen Produzenten, der langfristige Anbau von Kartoffeln und Tomaten auf denselben Flächen, unsachgemäße Fungizidbehandlungen oder deren völlige Abwesenheit führen zu schweren Epiphytotien im privaten Sektor, deren Ergebnis kostenlos ist Kreuzung, Hybridisierung und Bildung von Oosporen in privaten Gärten. Infolgedessen wird eine sehr hohe genotypische Vielfalt des Pathogens beobachtet, wenn fast jeder Stamm in seinem Genotyp einzigartig ist (Elansky et al., 2001, 2015). Das Pflanzen von Pflanzkartoffeln verschiedener genetischer Herkunft macht es unwahrscheinlich, dass klonale Linien entstehen, die darauf spezialisiert sind, eine bestimmte Sorte anzugreifen. Die in einem solchen Fall ausgewählten Stämme zeichnen sich durch ihre Vielseitigkeit in Bezug auf die betroffenen Sorten aus. Die meisten von ihnen weisen eine nahezu maximale Anzahl von Virulenzgenen auf. Dies unterscheidet sich stark von dem System der "klonalen Linien", das für große Felder landwirtschaftlicher Betriebe mit einem ordnungsgemäß installierten System zum Schutz vor Spätbrand typisch ist. "Klonale Linien" (wenn alle Stämme des Krankheitserregers der Spätfäule auf dem Feld durch einen oder mehrere Genotypen repräsentiert werden) sind in Ländern allgegenwärtig, in denen der Kartoffelanbau ausschließlich von großen Farmen betrieben wird: den USA, den Niederlanden, Dänemark usw. In England, Irland, Polen, wo auch Haushaltsgrundstücke traditionell weit verbreitet sind Kartoffelanbau gibt es auch eine höhere genotypische Vielfalt in privaten Gärten. Ende des 20. Jahrhunderts waren im asiatischen und fernöstlichen Teil Russlands "klonale Linien" weit verbreitet (Elansky et al., 2001), was offenbar auf die Verwendung derselben Kartoffelsorten ausschließlich zum Anpflanzen zurückzuführen ist. In jüngster Zeit begann sich auch die Situation in diesen Regionen zu ändern, um die genotypische Vielfalt der Populationen zu erhöhen.
Das Fehlen intensiver Behandlungen mit fungiziden Präparaten hat eine weitere direkte Folge: In den Gärten häufen sich keine resistenten Stämme an. In der Tat zeigen unsere Ergebnisse, dass Metalaxyl-resistente Stämme in privaten Gärten signifikant seltener vorkommen als in kommerziellen Pflanzungen.
Die für private Gärten typische Nähe von Kartoffel- und Tomatenpflanzungen erleichtert die Migration von Stämmen zwischen diesen Kulturen, wodurch im letzten Jahrzehnt unter den aus Kartoffeln isolierten Stämmen der Anteil der Stämme, die das Gen für die Resistenz gegen Kirschtomatensorten (T1) tragen, bisher nur charakteristisch war Tomatenstämme. Stämme mit dem T1-Gen sind in den meisten Fällen sowohl gegenüber Kartoffeln als auch gegenüber Tomaten sehr aggressiv.
In den letzten Jahren trat die Spätfäule bei Tomaten in vielen Fällen früher auf als bei Kartoffeln. Tomatensämlinge können mit Oosporen im Boden oder Oosporen befallen sein, die in Tomatensamen vorhanden sind oder an diesen haften (Rubin et al., 2001). In den letzten 15 Jahren ist eine große Anzahl von kostengünstig verpacktem Saatgut, das hauptsächlich importiert wurde, in den Läden erschienen, und die meisten kleinen Hersteller haben auf die Verwendung dieses Saatguts umgestellt. Die Samen können Stämme mit Genotypen bringen, die für die Regionen ihres Wachstums typisch sind. In Zukunft werden diese Genotypen in den privaten Prozess in privaten Gärten einbezogen, was zur Entstehung völlig neuer Genotypen führt.
Somit kann festgestellt werden, dass private Gärten ein globaler "Schmelztiegel" sind, in dem durch den Austausch von genetischem Material vorhandene Genotypen verarbeitet werden und völlig neue entstehen. Darüber hinaus erfolgt ihre Selektion unter Bedingungen, die sich stark von denen unterscheiden, die für Kartoffeln in großen Betrieben geschaffen wurden: das Fehlen einer fungiziden Presse, die Gleichmäßigkeit der Sorten in den Sorten, das Überwiegen von Pflanzen, die von verschiedenen Formen viraler und bakterieller Infektionen betroffen sind, die Nähe zu Tomaten und wilden Nachtschatten, die aktive Kreuzung und die Bildung von Oosporen, die Möglichkeit für Oosporen als Infektionsquelle für das nächste Jahr.
All dies führt zu einer sehr hohen genotypischen Vielfalt der Hinterhofpopulationen. Unter den Bedingungen der Epiphytotik in Gemüsegärten breitet sich die Spätfäule sehr schnell aus und es werden große Mengen an Sporen freigesetzt, die zu nahe gelegenen kommerziellen Pflanzungen fliegen. Nachdem sie jedoch mit dem richtigen System der Agrartechnologie und des chemischen Schutzes in kommerzielle Felder eingetreten sind, haben die angekommenen Sporen praktisch keine Gelegenheit, Epiphytotika auf dem Feld zu initiieren, was auf das Fehlen klonizidresistenter und auf die kultivierte Sorte spezialisierter klonaler Linien zurückzuführen ist.
Eine weitere Quelle für das primäre Inokulum können erkrankte Knollen sein, die in kommerziellen Sämlingen gefangen sind. Diese Knollen wurden in der Regel auf Feldern mit guter Agrartechnologie und intensivem Chemikalienschutz angebaut. Die Genotypen der Isolate, die die Knollen beeinflussten, sind an die Entwicklung ihrer eigenen Sorte angepasst. Diese Stämme sind für das kommerzielle Pflanzen wesentlich gefährlicher als Inokulum aus privaten Gärten. Die Ergebnisse unserer Studien stützen diese Annahme ebenfalls. Populationen, die von großen Feldern mit ordnungsgemäßem Chemikalienschutz und guter Agrartechnologie isoliert wurden, unterscheiden sich nicht in ihrer hohen genotypischen Vielfalt. Oft sind dies mehrere klonale Linien, die sehr aggressiv sind.
Stämme aus kommerziellem Saatgut können in Gemüsegärten in Populationen gelangen und an den darin ablaufenden Prozessen beteiligt sein. In einem Gemüsegarten wird ihre Wettbewerbsfähigkeit jedoch viel geringer sein als in einem kommerziellen Bereich, und bald werden sie nicht mehr in Form einer klonalen Linie existieren, aber ihre Gene können in der „Garten“ -Population verwendet werden.
Die Infektion, die sich während der Ernte an "freiwilligen" Pflanzen und auf Haufen von Keulknollen entwickelt, ist für Russland nicht so relevant, weil In den wichtigsten Kartoffelanbaugebieten Russlands wird ein tiefes Einfrieren des Winterbodens beobachtet, und Pflanzen aus Knollen, die im Boden überwintern, entwickeln sich selten. Darüber hinaus überlebt der Erreger der Spätfäule, wie unsere Experimente zeigen, auch bei Knollen, die ihre Lebensfähigkeit beibehalten haben, bei negativen Temperaturen nicht. In der trockenen Zone, in der der Anbau von Frühkartoffeln praktiziert wird, ist die Spätfäule aufgrund der trockenen und heißen Vegetationsperiode eher selten.
Daher beobachten wir derzeit die Aufteilung der Populationen von P. infestans in "Feld" - und "Garten" -Populationen. In den letzten Jahren wurden jedoch Prozesse beobachtet, die zur Konvergenz und gegenseitigen Durchdringung von Genotypen aus diesen Populationen führten.
Unter ihnen ist eine allgemeine Zunahme der Alphabetisierung kleiner Erzeuger, das Auftreten erschwinglicher kleiner Packungen Pflanzkartoffeln, die Verbreitung fungizider Präparate in kleinen Packungen und der Verlust der Angst vor "Chemie" durch die Bevölkerung festzustellen.
Situationen entstehen, in denen dank der intensiven Tätigkeit eines Lieferanten ganze Dörfer mit Samenknollen derselben Sorte bepflanzt und mit kleinen Paketen derselben Pestizide versehen werden. Es ist davon auszugehen, dass Kartoffeln der gleichen Sorte auf kommerziellen Anpflanzungen in der Nähe zu finden sind.
Auf der anderen Seite fördern einige Pestizidhandelsunternehmen „Budget“ -chemische Behandlungsprogramme. In diesem Fall wird die Anzahl der empfohlenen Behandlungen unterschätzt und die billigsten Fungizide werden angeboten. Der Schwerpunkt liegt nicht auf der Verhinderung der Entwicklung einer Spätfäule bis zum Mähen der Spitzen, sondern auf einer gewissen Verzögerung der Epiphytotie, um die Ausbeute zu erhöhen. Solche Regelungen sind wirtschaftlich gerechtfertigt, wenn Warenkartoffeln aus minderwertigem Saatgut angebaut werden, wenn grundsätzlich keine Frage eines hohen Ertrags besteht. In diesem Fall trägt jedoch im Gegensatz zu den Gartenpopulationen der ausgeglichene genetische Hintergrund der Kartoffel zur Auswahl spezifischer physiologischer Rassen bei, die für diese Sorte sehr gefährlich sind.
Im Allgemeinen erscheinen uns die Tendenzen zur Konvergenz von "Garten" - und "Feld" -Methoden der Kartoffelproduktion ziemlich gefährlich. Um ihre negativen Folgen sowohl im privaten als auch im gewerblichen Bereich zu vermeiden, müssen sowohl das Sortiment an Pflanzkartoffeln als auch das Angebot an Fungiziden, die privaten Eigentümern in kleinen Verpackungen angeboten werden, sowie die Verfolgung von Kartoffelschutzsystemen und die Verwendung von fungiziden Präparaten im gewerblichen Bereich kontrolliert werden.
In den Bereichen des Privatsektors gibt es eine intensive Entwicklung nicht nur der Spätfäule, sondern auch von Alternaria. Die meisten Eigentümer privater Haushaltsgrundstücke ergreifen keine besonderen Maßnahmen zum Schutz vor Alternaria und verwechseln die Entwicklung von Alternaria mit dem natürlichen Welken der Spitzen oder der Entwicklung der Spätfäule. Mit der massiven Entwicklung von Alternaria bei anfälligen Sorten können Haushaltsgrundstücke daher als Inokulumquelle für kommerzielle Pflanzungen dienen.
Variabilitätsmechanismen
Mutationsprozess
Da das Auftreten von Mutationen ein zufälliger Prozess ist, der mit einer geringen Häufigkeit abläuft, hängt das Auftreten von Mutationen an jedem Ort von der Häufigkeit der Mutation dieses Ortes und der Größe der Population ab. Bei der Untersuchung der Häufigkeit von Mutationen von P. infestans-Stämmen wird üblicherweise die Anzahl der Kolonien bestimmt, die nach Behandlung mit chemischen oder physikalischen Mutagenen auf selektiven Nährmedien gezüchtet wurden. Wie aus den in Tabelle 8 dargestellten Daten ersichtlich ist, kann sich die Mutationshäufigkeit desselben Stammes an verschiedenen Orten um mehrere Größenordnungen unterscheiden. Die hohe Häufigkeit von Mutationen in der Resistenz gegen Metalaxyl kann einer der Gründe für die Akkumulation von Stämmen sein, die in der Natur dagegen resistent sind.
Die Häufigkeit spontaner oder induzierter Mutationen, berechnet anhand von Laborexperimenten, entspricht aus folgenden Gründen nicht immer den in natürlichen Populationen ablaufenden Prozessen:
1. Bei asynchronen Kernspaltungen ist es unmöglich, die Häufigkeit von Mutationen pro Kerngeneration abzuschätzen. Daher liefern die meisten Experimente nur Informationen direkt über die Häufigkeit von Mutationen, ohne zwischen zwei Mutationsereignissen und einem Ereignis nach Mitose zu unterscheiden.
2. Einzelschrittmutationen verringern normalerweise das Gleichgewicht des Genoms, daher nimmt mit dem Erwerb einer neuen Eigenschaft die allgemeine Fitness des Organismus ab. Die meisten experimentell erhaltenen Mutationen weisen eine verringerte Aggressivität auf und werden nicht in natürlichen Populationen aufgezeichnet. Somit war der Korrelationskoeffizient zwischen dem Grad der Resistenz von P. infestans-Mutanten gegen Phenylamid-Fungizide und der Wachstumsrate in einer künstlichen Umgebung im Durchschnitt (-0,62) und der Resistenz gegen Fungizide und der Aggressivität auf Kartoffelblättern (-0,65) (Derevyagina et al. , 1993), was auf die geringe Fitness der Mutanten hinweist. Mutationen in der Resistenz gegen Dimethomorph gingen auch mit einer starken Abnahme der Lebensfähigkeit einher (Bagirova et al., 2001).
3. Die meisten spontanen und induzierten Mutationen sind rezessiv und manifestieren sich nicht phänotypisch in Experimenten, sondern bilden eine verborgene Variabilitätsreserve in natürlichen Populationen. In Laborexperimenten isolierte Mutantenstämme tragen dominante oder semi-dominante Mutationen (Kulish und Dyakov, 1979). Offensichtlich erklärt die Nukleardiploidie erfolglose Versuche, Mutanten unter dem Einfluss von UV-Bestrahlung zu erhalten, die auf zuvor resistenten Sorten virulent sind (McKee, 1969). Nach Berechnungen des Autors können solche Mutationen mit einer Häufigkeit von weniger als 1: 500000 auftreten. Der Übergang rezessiver Mutationen in einen homozygoten, phänotypisch exprimierten Zustand kann aufgrund einer sexuellen oder asexuellen Rekombination erfolgen (siehe unten). Selbst in diesem Fall kann die Mutation jedoch durch die dominanten Allele der Wildtypkerne im cenotischen (mehrkernigen) Myzel maskiert und nur während der Bildung einkerniger Zoosporen phänotypisch fixiert werden.
Tabelle 8. Häufigkeit von P. infestans-Mutationen zu wachstumshemmenden Substanzen unter Einwirkung von Nitrosomethylharnstoff (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
Verbindung | Mutationshäufigkeit |
Oxytetracyclin | X 6,9 10-8 |
Blasticidin S. | 7,2 x 10-8 |
Streptomycin | 8,3 х10-8 |
Trichothecin | X 1,8 10-8 |
Cycloheximid | X 2,1 10-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Dimethomorph | X 6,3 10-7 |
Metalaxil | X 6,9 10-6 |
Populationsgrößen spielen auch eine entscheidende Rolle beim Auftreten spontaner Mutationen. In sehr großen Populationen, in denen die Anzahl der Zellen N> 1 / a ist, wobei a die Mutationsrate ist, hört die Mutation auf, ein zufälliges Phänomen zu sein (Kvitko, 1974).
Berechnungen zeigen, dass bei einem durchschnittlichen Befall eines Kartoffelfeldes (35 Flecken pro Pflanze) täglich 8x1012 Sporen auf einem Hektar gebildet werden (Dyakov und Suprun, 1984). Offensichtlich enthalten solche Populationen alle Mutationen, die durch die Art des Austauschs an jedem Ort zulässig sind. Sogar eine seltene Mutation, die mit einer Häufigkeit von 10-9 auftritt, wird von tausend von Millionen Individuen erworben, die auf einem Hektar Kartoffelfeld leben. Für Mutationen, die mit einer höheren Häufigkeit auftreten (zum Beispiel 10-6), können in einer solchen Population täglich verschiedene gepaarte Mutationen auftreten (gleichzeitig an zwei Orten), d.h. Der Mutationsprozess ersetzt die Rekombination.
Migrationen
Für P. infestans sind zwei Hauptmigrationsarten bekannt: das Schließen von Entfernungen (innerhalb eines Kartoffelfelds oder benachbarter Felder) durch Ausbreitung von Zoosporangien durch Luftströmungen oder Regenspray und große Entfernungen - durch Pflanzen von Knollen oder transportierten Tomatenfrüchten. Die erste Methode sieht die Erweiterung des Krankheitsschwerpunkts vor, die zweite die Schaffung neuer Herde an Orten, die von der primären entfernt sind.
Die Ausbreitung einer Infektion mit Tomatenknollen und Früchten trägt nicht nur zur Entstehung der Krankheit an neuen Orten bei, sondern ist auch die Hauptquelle für die genetische Vielfalt in Populationen. In der Region Moskau werden Kartoffeln aus verschiedenen Regionen Russlands und Westeuropas angebaut. Tomatenfrüchte werden aus den südlichen Regionen Russlands (Region Astrachan, Region Krasnodar, Nordkaukasus) gebracht. Tomatensamen, die auch als Infektionsquellen dienen können (Rubin et al., 2001), werden ebenfalls aus den südlichen Regionen Russlands, Chinas, europäischer Länder und anderer Länder importiert.
Nach Berechnungen von E. Mayr (1974) überschreiten genetische Veränderungen in einer lokalen Population, die durch Mutationen verursacht werden, selten 10-5 pro Locus, während in offenen Populationen der Austausch aufgrund des Gegenflusses von Genen mindestens 10-3 - 10-4 beträgt.
Die Migration infizierter Knollen ist für den Eintritt von P. infestans nach Europa verantwortlich und breitet sich in allen Regionen der Welt aus, in denen Kartoffeln angebaut werden. Sie verursachten die schwerwiegendsten Bevölkerungsveränderungen. Auf dem Territorium des Russischen Reiches trat fast zeitgleich mit seinem Auftreten in Westeuropa eine späte Kartoffelfäule auf.
Da die Krankheit erstmals 1846-1847 in den baltischen Staaten festgestellt wurde und sich erst in den folgenden Jahren in Belarus und den nordwestlichen Regionen Russlands ausbreitete, ist ihre westeuropäische Herkunft offensichtlich. Die erste Quelle der Spätfäule in der Alten Welt ist nicht so offensichtlich. Die von Fry et al. Entwickelte Hypothese (Fry et al., 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin et al., 1994) legt nahe, dass der Parasit zuerst von Mexiko nach Nordamerika kam, wo er sich über Nutzpflanzen ausbreitete und dann nach Westeuropa transportiert wurde (Abb. 7).
Infolge der wiederholten Drift (doppelter Effekt des "Engpasses") gelangten einzelne Klone nach Europa, deren Nachkommen im gesamten Gebiet der Alten Welt, in dem Kartoffeln angebaut werden, eine Pandemie auslösten. Als Beweis für diese Hypothese führen die Autoren zum einen die Allgegenwart nur eines Paarungstyps (A1) und zum anderen die Homogenität der Genotypen der untersuchten Stämme aus verschiedenen Regionen an (alle basieren auf molekularen Markern, darunter 2 Isozym-Loci, DNA-Fingerabdruckmuster und Die Struktur der mitochondrialen DNA ist identisch und entspricht dem in den USA beschriebenen Klon US-1. Einige Daten lassen jedoch Zweifel an zumindest einigen Bestimmungen der angegebenen Hypothese aufkommen. Die Analyse der mitochondrialen DNA von P. infestans, die aus Herbariumkartoffelproben isoliert wurde, die während der ersten epiphytotischen Periode der 40er Jahre infiziert wurden, zeigte, dass sie sich in der Struktur der mitochondrialen DNA vom Klon US-1 unterscheiden, was daher zumindest der Fall war nicht die einzige Infektionsquelle in Europa (Ristaino et al., 2001).
In den 80er Jahren des XNUMX. Jahrhunderts verschlechterte sich die Situation der Spätfäule erneut. Die folgenden Änderungen sind aufgetreten:
1) Die durchschnittliche Aggressivität der Bevölkerung hat zugenommen, was insbesondere zur weit verbreiteten Ausbreitung der schädlichsten Form der Spätfäule geführt hat - Schädigung der Blattstiele und Stängel.
2) Die Zeit der Spätfäule bei Kartoffeln hat sich verschoben - von Ende Juli bis Anfang Juli und sogar bis Ende Juni.
3) Der Paarungstyp A2, der zuvor in der Alten Welt fehlte, ist allgegenwärtig geworden.
Den Veränderungen gingen zwei Ereignisse voraus: der massive Einsatz des neuen Fungizids Metalaxyl (Schwinn und Staub, 1980) und das Aufkommen Mexikos als weltweiter Exporteur von Kartoffeln (Niederhauser, 1993). Dementsprechend wurden zwei Gründe für Populationsveränderungen angeführt - die Umwandlung des Paarungstyps unter dem Einfluss von Metalaxyl (Ko, 1994) und die massive Einführung neuer Stämme mit infizierten Knollen aus Mexiko (Fry und Goodwin, 1995). Obwohl Interkonversionen von Paarungstypen unter dem Einfluss von Metalaxyl nicht nur von Ko erhalten wurden, sondern auch in Arbeiten, die im Labor der Moskauer Staatlichen Universität durchgeführt wurden (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), ist die zweite Hypothese vorzuziehen. Zusammen mit dem Auftreten der zweiten Art der Paarung fanden schwerwiegende Veränderungen in den Genotypen der russischen P. infestans-Stämme statt, einschließlich der neutralen Gene (Isozym- und RFLP-Loci) sowie in der Struktur der mitochondrialen DNA. Der Komplex dieser Veränderungen kann nicht durch die Wirkung von Metalaxyl erklärt werden, sondern es gab einen massiven Import neuer Stämme aus Mexiko, die aggressiver (Kato et al., 1997) die alten Stämme (US-1) verdrängten und in der Bevölkerung dominierten. Die Veränderung der Zusammensetzung der europäischen Bevölkerung erfolgte in sehr kurzer Zeit - von 1980 bis 1985 (Fry et al., 1992). Auf dem Gebiet der ehemaligen UdSSR wurden 1985 in Sammlungen aus Estland „neue Stämme“ gefunden, also früher als in Polen und Deutschland (Goodwin et al., 1994). Das letzte Mal, dass der "alte Stamm US-1" in Russland 1993 aus einer infizierten Tomate in der Region Moskau isoliert wurde (Dolgova et al., 1997). Auch in Frankreich wurden bis Anfang der 90er Jahre „alte“ Stämme in Tomatenpflanzungen gefunden, dh nachdem sie auf Kartoffeln längst verschwunden waren (Leberton und Andrivon, 1998). Veränderungen in P. infestans-Stämmen wirkten sich auf viele Merkmale aus, einschließlich solcher von großer praktischer Bedeutung, und erhöhten die Schädlichkeit der Spätfäule.
Sexuelle Rekombination
Damit die sexuelle Rekombination zur Variabilität beiträgt, ist zum einen das Vorhandensein von zwei Arten der Paarung in der Population in einem Verhältnis nahe 1: 1 und zum anderen das Vorhandensein der anfänglichen Populationsvariabilität erforderlich.
Das Verhältnis der Paarungstypen variiert stark in verschiedenen Populationen und sogar in verschiedenen Jahren in einer Population (Tabelle 9,10, 90). Die Gründe für solch drastische Veränderungen in der Häufigkeit von Paarungstypen in Populationen (wie zum Beispiel in Russland oder in Israel in den frühen 2002er Jahren des letzten Jahrhunderts) sind unbekannt, aber es wird angenommen, dass dies auf die Einführung wettbewerbsfähigerer Klone zurückzuführen ist (Cohen, XNUMX).
Einige indirekte Daten geben den Verlauf des sexuellen Prozesses in bestimmten Jahren und in bestimmten Regionen an:
1) Studien an Populationen aus der Region Moskau zeigten, dass in 13 Populationen, in denen der Anteil des A2-Paarungstyps weniger als 10% betrug, die für drei Isozym-Loci berechnete genetische Gesamtvielfalt 0,08 betrug und in 14 Populationen, in denen der Anteil von A2 überstieg 30% war die genetische Vielfalt doppelt so hoch (0,15) (Elansky et al., 1999). Je höher die Wahrscheinlichkeit des Geschlechtsverkehrs ist, desto größer ist die genetische Vielfalt der Bevölkerung.
2) Die Beziehung zwischen dem Verhältnis der Paarungstypen in Populationen und der Intensität der Oosporenbildung wurde in Israel (Cohen et al., 1997) und in Holland beobachtet
(Flier et al., 2004). Unsere Studien haben gezeigt, dass in Populationen, in denen Isolate mit dem Paarungstyp A2 62, 17, 9 und 6% ausmachten, Oosporen in 78, 50, 30 und 15% der analysierten Kartoffelblätter (mit 2 oder mehr Flecken) gefunden wurden.
Proben mit 2 oder mehr Spots enthielten viel häufiger Oosporen als Proben mit 1 Spot (32 bzw. 14% der Proben) (Apryshko et al., 2004).
Oosporen waren in den Blättern der mittleren und unteren Schicht der Kartoffelpflanze viel häufiger (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) In einigen Regionen wurden einzigartige Genotypen entdeckt, deren Auftreten mit sexueller Rekombination verbunden ist. So wurden in Polen 1989 und in Frankreich 1990 Stämme homozygot für die Glucose-6-
Phosphatisomerase (GPI 90/90). Da bisher 10 Jahre lang nur 90/100 Heterozygoten angetroffen wurden, wird Homozygotie der sexuellen Rekombination zugeschrieben (Sujkowski et al., 1994). In Kolumbien (USA) sind Isolate, die A2 mit GPI 100/110 und A1 mit GPI 100/100 kombinieren, jedoch am Ende der Saison 1994 (16. August und 9. September) häufig Stämme mit rekombinanten Genotypen (A1 GPI 100/110) und A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) In einigen Populationen aus Polen (Sujkowski et al., 1994) und dem Nordkaukasus (Amatkhanova et al., 2004) entspricht die Verteilung der Fingerabdruck-DNA-Loci und Allozym-Protein-Loci der Hardy-Weinberg-Verteilung, was darauf hinweist
über den hohen Anteil des Beitrags der sexuellen Rekombination zur Variabilität der Populationen. In anderen Regionen Russlands wurde keine Übereinstimmung mit der Hardy-Weinberg-Verteilung in Populationen gefunden, aber das Vorhandensein eines Bindungsungleichgewichts wurde gezeigt, was auf das Überwiegen der klonalen Reproduktion hinweist (Elansky et al., 1999).
5) Die genetische Vielfalt (GST) zwischen Stämmen mit unterschiedlichen Paarungstypen (A1 und A2) war geringer als zwischen verschiedenen Populationen (Sujkowski et al., 1994), was indirekt auf sexuelle Kreuzungen hinweist.
Gleichzeitig kann der Beitrag der sexuellen Rekombination zur Bevölkerungsvielfalt nicht sehr hoch sein. Dieser Beitrag wurde für die Bevölkerung der Region Moskau berechnet (Elansky et al., 1999). Nach den Berechnungen von Lewontin (1979) "wird eine Rekombination, die aus zwei Loci neue Varianten mit einer Häufigkeit erzeugen kann, die das Produkt ihrer Heterozygotie nicht überschreitet, nur dann wirksam, wenn die Heterozygotiewerte für beide Allele bereits hoch sind."
Bei einem für die Region Moskau typischen Verhältnis der beiden Paarungsarten von 4: 1 beträgt die Rekombinationsfrequenz 0,25. Die Wahrscheinlichkeit, dass gekreuzte Stämme für zwei der drei untersuchten Isozym-Loci in den untersuchten Populationen heterozygot sind, betrug 0,01 (2 von 177 Stämmen). Folglich sollte die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Doppelheterozygoten als Ergebnis der Rekombination ihr Produkt multipliziert mit der Wahrscheinlichkeit der Kreuzung (0,25 × 0,02 × 0,02) = 10–4, d. H. Sexuelle Rekombinanten fallen normalerweise nicht in die untersuchte Stammprobe. Diese Berechnungen wurden für Populationen aus der Region Moskau durchgeführt, die durch eine relativ hohe Variabilität gekennzeichnet sind. In monomorphen Populationen wie den sibirischen kann der sexuelle Prozess, selbst wenn er in einzelnen Populationen stattfindet, ihre genetische Vielfalt nicht beeinflussen.
Darüber hinaus ist P. infestans durch eine häufige Chromosomenfehlausrichtung bei Meiose gekennzeichnet, die zu Aneuploidie führt (Carter et al., 1999). Solche Störungen verringern die Fruchtbarkeit der Hybriden.
Parasexuelle Rekombination, mitotische Genumwandlung
In Experimenten zum Spleißen von P. infestans-Stämmen mit Mutationen in Resistenz gegen verschiedene Wachstumsinhibitoren wurde das Auftreten von Misolaten gefunden, die gegen beide Inhibitoren resistent sind (Shattock und Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Stämme, die gegen zwei Wachstumsinhibitoren resistent waren, entstanden als Ergebnis der Heterokaryotisierung des Myzels, und in diesem Fall spalteten sie sich während der Reproduktion durch mononukleäre Zoosporen (Judelson, Ge Yang, 1998) oder spalteten sich nicht in monozoosporösen Nachkommen, weil sie tetraploide (da die anfänglichen Isolate diploide) Kerne hatten (K. 1979). Heterozygote Diploide trennten sich aufgrund von Haploidisierung, Chromosomen-Nicht-Disjunktion und mitotischer Überkreuzung mit sehr geringer Häufigkeit (Poedinok et al., 1982). Die Häufigkeit dieser Prozesse könnte mit Hilfe bestimmter Effekte auf heterozygote Diploide (z. B. UV-Bestrahlung keimender Sporen) erhöht werden.
Obwohl die Bildung von vegetativen Hybriden mit doppelter Resistenz nicht nur in vitro, sondern auch in Kartoffelknollen auftritt, die mit einer Mischung von Mutanten infiziert sind (Kulish et al., 1978), ist es ziemlich schwierig, die Rolle der parasexuellen Rekombination bei der Erzeugung neuer Genotypen in Populationen zu bewerten. Die Häufigkeit der Bildung von Segreganten aufgrund von Haploidisierung, Nicht-Disjunktion von Chromosomen und mitotischem Übergang ohne Spezialeffekte ist vernachlässigbar (weniger als 10-3).
Das Auftreten homozygoter Segreganten heterozygoter Stämme kann sowohl auf mitotischer Überkreuzung als auch auf mitotischer Genumwandlung beruhen, die in P. sojae je nach Stamm mit einer Häufigkeit von 3 x 10 & supmin; ² bis 2 x 5 & supmin; & sup10; pro Locus auftritt (Chamnanpunt et al. , 5).
Obwohl sich die Häufigkeit des Auftretens von Heterokaryonen und heterozygoten Diploiden als unerwartet hoch herausstellte (bis zu zehn Prozent), tritt dieser Prozess nur auf, wenn mutierte Kulturen, die von demselben Stamm erhalten wurden, gespleißt werden. Bei Verwendung verschiedener aus der Natur isolierter Stämme tritt aufgrund der vegetativen Inkompatibilität keine Heterokaryotisierung auf (oder tritt nur sehr selten auf) (Poedinok und Dyakov, 1981; Anikina et al., 1997b; Cherepennikova-Anikina et al., 2002). Folglich kann die Rolle der parasexuellen Rekombination nur auf die intraklonale Rekombination in heterozygoten Kernen und den Übergang einzelner Gene in einen homozygoten Zustand ohne sexuellen Prozess reduziert werden. Dieser Prozess kann bei Stämmen mit rezessiven oder semi-dominanten Mutationen der Fungizidresistenz von epidemiologischer Bedeutung sein. Sein Übergang in einen homozygoten Zustand aufgrund des parasexuellen Prozesses erhöht die Resistenz des Trägers der Mutation (Dolgova, Dyakov, 1986).
Introgression von Genen
Heterothallische Arten Phytophthora können sich mit der Bildung hybrider Oosporen kreuzen (siehe Vorob'eva und Gridnev, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). Die natürliche Hybride der beiden Phytophthora-Arten war so aggressiv, dass sie in Großbritannien Tausende von Erlen tötete (Brasier et al., 1999). P. infestans kann bei anderen Arten der Gattung (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum usw.) an gewöhnlichen Wirtspflanzen und im Boden auftreten, in der Literatur gibt es jedoch nur wenige Informationen über die Möglichkeit interspezifischer Hybriden. Unter Laborbedingungen wurden Hybride zwischen P. infestans und P. Mirabilis erhalten (Goodwin und Fry, 1994).
Tabelle 9. Der Anteil von P. infestans-Stämmen mit A2-Paarungstyp in verschiedenen Ländern der Welt im Zeitraum von 1990 bis 2000 (gemäß den Daten offener Literaturquellen und Websites www.euroblight.net, www.eucablight.org)
Land | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Weißrussland | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Belgien | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ecuador | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Estland | 8 (12) | ||||||||||
England | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Finnland | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Frankreich | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Ungarn | 72 (32) | ||||||||||
Irland | 4 (145) | ||||||||||
Norden. Irland | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Niederlande | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Norwegen | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Peru | 0 (34, 1984-86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Polen | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Schottland | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Schweden | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Wales | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Korea | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
China | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Kolumbien | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Uruguay | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Marokko | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
Mexiko (Toluca) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Tabelle 10. Der Anteil von P. infestans-Stämmen mit A2-Paarungstyp in verschiedenen Ländern der Welt im Zeitraum von 2000 bis 2011
Land | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Österreich | 65 (83) | ||||||||||
Weißrussland | 42 (78) | ||||||||||
Belgien | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Schweiz | 89 (19) | ||||||||||
Tschechien | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Deutschland | 95 (53) | ||||||||||
Dänemark | 48 (52) | ||||||||||
Ecuador | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Estland | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
England | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Finnland | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Frankreich | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Ungarn | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Norden. Irland | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Niederlande | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Norwegen | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Peru | 0 (36) | ||||||||||
Polen | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Schottland | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Schweden | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Slowakei | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Wales | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Korea | 46 (26) | ||||||||||
Brasilien | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
China | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Vietnam | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Dynamik der genotypischen Zusammensetzung von Populationen
Änderungen der genotypischen Zusammensetzung von P. infestans-Populationen können unter dem Einfluss der Migration neuer Klone aus anderen Regionen, landwirtschaftlicher Praktiken (Sortenwechsel, Anwendung von Fungiziden) und Wetterbedingungen auftreten. Externe Einflüsse wirken sich auf verschiedene Klone in verschiedenen Stadien des Lebenszyklus aus. Daher erfahren Populationen jährlich zyklische Änderungen der Häufigkeit von Genen, die einer Selektion unterliegen, aufgrund einer Änderung der dominanten Rolle von Gendrift und Selektion.
Einfluss der Sorte
Neue Sorten mit wirksamen Genen für vertikale Resistenz (R-Gene) sind ein starker selektiver Faktor bei der Auswahl von Klonen mit komplementären Virulenzgenen in P. infestans-Populationen. In Abwesenheit einer unspezifischen Resistenz in der Kartoffelsorte, die das Wachstum der Pathogenpopulation hemmt, erfolgt der Prozess der Veränderung der dominanten Klone in der Population sehr schnell. Nach der Ausbreitung der Sorte Domodedovsky, die das R3-Resistenzgen aufweist, in der Region Moskau stieg die Häufigkeit der für diese Sorte virulenten Klone innerhalb eines Jahres von 0,2 auf 0,82 (Dyakov und Derevjagina, 2000).
Die Veränderung der Häufigkeit von Virulenzgenen (Pathotypen) in Populationen erfolgt jedoch nicht nur unter dem Einfluss kultivierter Kartoffelsorten. Beispielsweise dominierten in Belarus bis 1977 Klone mit den Virulenzgenen 1 und 4, was durch den Anbau von Kartoffelsorten mit den Resistenzgenen R1 und R4 verursacht wurde (Dorozhkin, Belskaya, 1979). Ende der 70er Jahre des 2002. Jahrhunderts traten jedoch Klone mit unterschiedlichen Virulenzgenen und deren Kombinationen auf, und die komplementären Resistenzgene wurden in der Kartoffelzüchtung (Extravirulenzgene) nie verwendet (Ivanyuk et al., XNUMX). Der Grund für das Auftreten solcher Klone liegt offenbar in der Migration von infektiösem Material aus Mexiko mit Kartoffelknollen nach Europa. Zu Hause entwickelten sich diese Klone nicht nur auf Kulturkartoffeln, sondern auch auf Wildarten, die eine Vielzahl von Resistenzgenen tragen. Daher war die Kombination vieler Virulenzgene im Genom für das Überleben unter diesen Bedingungen erforderlich.
Sorten mit unspezifischer Resistenz verzögern durch Verringerung der Reproduktionsrate des Erregers die Entwicklung seiner Populationen, was, wie bereits erwähnt, eine Funktion der Anzahl ist. Da Aggressivität polygen ist, akkumulieren Klone, die eine größere Anzahl von Genen für "Aggressivität" enthalten, je früher, desto höher die Populationsgröße. Hochaggressive Rassen sind daher kein Produkt der Anpassung an kultivierte Sorten mit unspezifischer Resistenz, sondern werden im Gegenteil eher in Pflanzungen hoch anfälliger Sorten nachgewiesen, die Akkumulatoren der Parasitensporen sind.
So wurden in Russland die aggressivsten Populationen von P. Infestans in den Zonen der jährlichen Epiphytotien gefunden (Populationen aus den Regionen Sachalin, Leningrad und Brjansk). Die Aggressivität dieser Populationen erwies sich als höher als die mexikanische (Filippov et al., 2004).
Darüber hinaus bilden sich in den Blättern resistenter Sorten weniger Oosporen als in anfälligen (Hanson und Shattock, 1998), dh die unspezifische Resistenz der Sorte verringert auch die Rekombinationsfähigkeit des Parasiten und die Möglichkeit alternativer Überwinterungsmethoden.
Einfluss von Fungiziden
Fungizide verringern nicht nur die Anzahl von phytopathogenen Pilzen, d.h. beeinflussen die quantitativen Eigenschaften ihrer Populationen, können aber auch die Häufigkeit einzelner Genotypen ändern, d.h. Einfluss auf die qualitative Zusammensetzung der Populationen. Zu den wichtigsten Indikatoren für Populationen, die sich unter dem Einfluss von Fungiziden verändern, gehören: Veränderungen der Resistenz gegen Fungizide, Veränderungen der Aggressivität und Virulenz sowie Veränderungen des Fortpflanzungssystems.
Einfluss von Fungiziden auf die Resistenz und Aggressivität von Populationen
Das Ausmaß dieses Einflusses wird zunächst durch die Art des verwendeten Fungizids bestimmt, das bedingt in Polysit, Oligosit und Monosit unterteilt werden kann.
Ersteres umfasst die meisten Kontaktfungizide. Die Resistenz gegen sie (wenn überhaupt möglich) wird durch eine große Anzahl sehr schwach ausdrucksstarker Gene gesteuert. Diese Eigenschaften bestimmen das Fehlen sichtbarer Veränderungen der Resistenz der Bevölkerung nach Behandlung mit Fungiziden (obwohl in einigen Experimenten eine gewisse Erhöhung der Resistenz erzielt wurde). Die nach dem Besprühen mit Kontaktfungiziden erhaltene Pilzpopulation besteht aus zwei Gruppen von Stämmen:
1) Stämme, die in Bereichen von Pflanzen aufbewahrt werden, die nicht mit dem Arzneimittel behandelt wurden. Da kein Kontakt mit dem Fungizid bestand, ändert sich die Aggressivität und Resistenz dieser Stämme nicht.
2) Stämme in Kontakt mit dem Fungizid, deren Konzentration an den Kontaktpunkten niedriger als tödlich war. Wie oben erwähnt, ändert sich auch die Resistenz dieses Teils der Bevölkerung nicht aufgrund der teilweise schädlichen Wirkung des Fungizids selbst in subletaler Konzentration auf den Metabolismus der Pilzzelle, die allgemeine Fitness und ihre parasitäre Komponente, Aggressivität, Abnahme (Derevyagina und Dyakov, 1990).
Somit hat selbst ein Teil der Bevölkerung, der nicht gestorben ist, dem Kontakt mit dem Fungizid ausgesetzt ist, eine schwache Aggressivität und kann keine Quelle für Epiphytotika sein. Eine sorgfältige Behandlung, die die Häufigkeit des Anteils der Bevölkerung verringert, die nicht mit dem Fungizid in Kontakt kommt, ist daher eine Voraussetzung für den Erfolg von Schutzmaßnahmen. Die Resistenz gegen Oligosit-Fungizide wird durch mehrere additive Gene gesteuert.
Die Mutation jedes Gens führt zu einer gewissen Erhöhung der Resistenz, und der Gesamtgrad der Resistenz beruht auf der Hinzufügung solcher Mutationen. Daher erfolgt die Erhöhung des Widerstands schrittweise. Ein Beispiel für eine schrittweise Erhöhung der Resistenz sind Mutationen in der Resistenz gegen das Fungizid Dimethomorph, das häufig zum Schutz von Kartoffeln vor Spätfäule eingesetzt wird. Die Dimethomorph-Resistenz ist polygen und additiv. Eine einstufige Mutation erhöht die Resistenz geringfügig.
Jede nachfolgende Mutation verringert die Zielgröße und folglich die Häufigkeit nachfolgender Mutationen (Bagirova et al., 2001). Die Zunahme der durchschnittlichen Resistenz der Bevölkerung nach wiederholten Behandlungen mit dem Oligosit-Fungizid erfolgt schrittweise und allmählich. Die Geschwindigkeit dieses Prozesses wird durch mindestens drei Faktoren bestimmt: die Häufigkeit der Mutation von Resistenzgenen, den Resistenzkoeffizienten (das Verhältnis der letalen Dosis eines resistenten Stammes zu einem empfindlichen Stamm) und die Auswirkung von Mutationen in Resistenzgenen auf die Fitness.
Die Inzidenz jeder nachfolgenden Mutation ist geringer als bei der vorherigen, daher ist der Prozess dämpfend (Bagirova et al., 2001). Wenn jedoch Rekombinationsprozesse (sexuell oder parasexuell) in einer Population auftreten, ist es möglich, verschiedene elterliche Mutationen in einem Hybridstamm zu kombinieren und den Prozess zu beschleunigen. Daher erhalten Panmix-Populationen Resistenzen schneller als agamische und in letzteren Populationen, die keine vegetativen Inkompatibilitätsbarrieren aufweisen, schneller als Populationen, die durch solche Barrieren geteilt werden. In dieser Hinsicht beschleunigt das Vorhandensein von Stämmen in Populationen, die sich in der Art der Paarung unterscheiden, den Prozess des Erwerbs von Resistenz gegen Oligosit-Fungizide.
Der zweite und dritte Faktor tragen nicht zur schnellen Akkumulation von Dimethomorph-resistenten Stämmen in Populationen bei. Jede nachfolgende Mutation verdoppelt ungefähr die Resistenz, was unbedeutend ist, und verringert gleichzeitig sowohl die Wachstumsrate in einer künstlichen Umgebung als auch die Aggressivität (Bagirova et al., 2001; Stem, Kirk, 2004). Vielleicht gibt es deshalb praktisch keine resistenten Stämme unter natürlichen P. infestans-Stämmen, selbst solche, die aus mit Dimethomorph behandelten Kartoffelpflanzungen stammen.
Eine mit einem Oligosit-Fungizid behandelte Population besteht ebenfalls aus zwei Gruppen von Stämmen: solchen, die nicht mit dem Fungizid in Kontakt gekommen sind und daher die ursprünglichen Eigenschaften nicht verändert haben (wenn in dieser Gruppe resistente Stämme gefunden werden, reichern sie sich aufgrund der höheren Aggressivität und Wettbewerbsfähigkeit empfindlicher Stämme nicht an). und Stämme in Kontakt mit subletalen Konzentrationen des Fungizids. Unter den letzteren ist die Akkumulation resistenter Stämme möglich, weil sie hier Vorteile gegenüber empfindlichen haben.
Daher ist bei der Verwendung von Oligosit-Fungiziden weniger eine gründliche Behandlung wichtig als eine hohe Konzentration des Arzneimittels, die um ein Vielfaches höher ist als die letale Dosis, da bei schrittweiser Mutagenese die anfängliche Resistenz mutierter Stämme gering ist.
Schließlich sind Mutationen in der Resistenz gegen Monosit-Fungizide sehr ausdrucksstark, dh eine einzelne Mutation kann ein hohes Maß an Resistenz bis hin zum vollständigen Verlust der Empfindlichkeit melden. Daher tritt die Zunahme der Resistenz von Populationen sehr schnell auf.
Ein Beispiel für solche Fungizide sind Phenylamide, einschließlich des häufigsten Fungizids Metalaxyl. Resistenzmutationen treten mit hoher Häufigkeit auf, und der Resistenzgrad in Mutanten ist sehr hoch - er übersteigt den empfindlichen Stamm um den Faktor tausend oder mehr (Derevyagina et al., 1993). Obwohl die Wachstumsrate und Aggressivität resistenter Mutanten vor dem Hintergrund des Todes anfälliger Stämme durch ein systemisches Fungizid abnimmt, wächst die Zahl der resistenten Populationen schnell und ihre Aggressivität nimmt parallel dazu zu. Daher kann nach mehreren Jahren der Verwendung des Fungizids die Aggressivität resistenter Stämme nicht nur der Aggressivität empfindlicher Stämme entsprechen, sondern diese auch übertreffen (Derevyagina und Dyakov, 1992).
Wirkung auf die sexuelle Rekombination
Da das häufige Auftreten des A2-Paarungstyps in Populationen von P. infestans mit der intensiven Verwendung von Metalaxyl gegen Spätfäule zusammenfiel, wurde angenommen, dass Metalaxyl die Umwandlung des Paarungstyps induziert. In P. parasitica wurde eine solche Umwandlung unter Einwirkung von Chloroneb und Metalaxyl experimentell nachgewiesen (Ko, 1994). Eine einzelne Passage auf einem Medium mit einer geringen Konzentration an Metalaxyl führte zur Entstehung homothallischer Isolate aus einem Stamm von P. infestans, der gegenüber Metalaxyl mit Paarungstyp A1 empfindlich ist (Savenkova und Cherepnikova-Anikina, 2002). Während nachfolgender Passagen auf Medien mit einer höheren Konzentration an Metalaxyl wurde kein einziges Isolat vom A2-Paarungstyp nachgewiesen, jedoch bildeten die meisten Isolate, wenn sie mit A2-Isolaten anstelle von Oosporen gekreuzt wurden, hässliche Myzelansammlungen und waren steril. Durch Passagen eines resistenten Stammes vom Paarungstyp A2 auf Medien mit einer hohen Konzentration an Metalaxyl konnten drei Formen von Paarungstypänderungen festgestellt werden: 1) vollständige Sterilität bei Kreuzung mit A1- und A2-Isolaten; 2) Homotallismus (Bildung von Oosporen in einer Monokultur); 3) Umwandlung des Paarungstyps A2 in A1. Somit kann Metalaxyl Veränderungen in den Paarungstypen in P. infestans-Populationen und folglich sexuelle Rekombination in diesen verursachen.
Einfluss auf die vegetative Rekombination
Einige Antibiotikaresistenzgene erhöhten die Häufigkeit der Hyphenheterokaryotisierung und der nuklearen Diploidisierung (Poedinok und Dyakov, 1981). Wie bereits erwähnt, tritt eine Heterokaryotisierung von Hyphen während der Fusion verschiedener Stämme von P. infestans aufgrund des Phänomens der vegetativen Inkompatibilität in diesem Pilz sehr selten auf. Gene für die Resistenz gegen einige Antibiotika können jedoch Nebenwirkungen haben, die sich in der Überwindung der vegetativen Inkompatibilität äußern. Diese Eigenschaft besaß das 1S-1-mutierte Streptomycin-Resistenzgen. Das Vorhandensein solcher Mutanten in den Feldpopulationen von Phytophthora kann den Fluss von Genen zwischen Stämmen erhöhen und die Anpassung der gesamten Population an neue Sorten oder Fungizide beschleunigen.
Bestimmte Fungizide und Antibiotika können die Häufigkeit der mitotischen Rekombination beeinflussen, was auch die Genotyphäufigkeit in Populationen verändern kann. Das weit verbreitete Fungizid Benomyl bindet an Beta-Tubulin, ein Protein, aus dem Mikrotubuli des Zytoskeletts aufgebaut sind, und stört dadurch die Prozesse der Chromosomentrennung in der Anaphase der Mitose, wodurch die Häufigkeit der mitotischen Rekombination erhöht wird (Hastie, 1970).
Das Fungizid para-Fluorphenylalanin, das zur Behandlung der niederländischen Ulmenkrankheit verwendet wird, hat die gleichen Eigenschaften. Para-Fluorphenylalanin erhöhte die Häufigkeit der Rekombination bei heterozygoten Diploiden P. infestans (Poedinok et al., 1982).
Zyklische Veränderungen in der genotypischen Zusammensetzung von Populationen im Lebenszyklus von P. infestans
Der klassische Entwicklungszyklus von P. infestans in der gemäßigten Zone besteht aus 4 Phasen.
1) Phase des exponentiellen Bevölkerungswachstums (polyzyklische Phase) mit kurzen Generationen. Diese Phase beginnt normalerweise im Juli und dauert 1,5 bis 2 Monate.
2) Die Phase des Stoppens des Bevölkerungswachstums aufgrund eines starken Rückgangs des Anteils an nicht betroffenem Gewebe oder des Einsetzens ungünstiger Wetterbedingungen. Diese Phase in Betrieben, in denen Blätter vor der Ernte frühzeitig entfernt werden, fällt aus dem Jahreszyklus heraus.
3) Die Überwinterungsphase bei Knollen, begleitet von einer signifikanten Abnahme der Populationsgröße aufgrund einer versehentlichen Infektion der Knollen, der langsamen Entwicklung der Infektion in ihnen, der Abwesenheit einer erneuten Infektion der Knollen, der Verrottung und Keulung der betroffenen Knollen unter normalen Lagerbedingungen.
4) Die Phase langsamer Entwicklung im Boden und an Sämlingen (monocyclische Phase), in der die Generationsdauer einen Monat oder mehr erreichen kann (Ende Mai - Anfang Juli). In der Regel sind kranke Blätter zu diesem Zeitpunkt selbst bei besonderen Beobachtungen schwer zu erkennen.
Phase des exponentiellen Bevölkerungswachstums (polyzyklische Phase)
Zahlreiche Beobachtungen (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) zeigten, dass zu Beginn der Epiphytotie schwach virulente und leicht aggressive Klone vorherrschen, die anschließend durch virulentere und aggressivere ersetzt werden. Die Wachstumsrate der Aggressivität der Population ist umso höher, je weniger resistent die Sorte der Wirtspflanze ist.
Mit zunehmender Population steigt die Konzentration sowohl selektiv wichtiger Gene, die in kommerzielle Sorten (R1-R4) eingeführt werden, als auch selektiv neutraler Gene (R5-R11). In den Populationen in der Nähe von Moskau stieg die durchschnittliche Virulenz von Ende Juli bis Mitte August von 1993 auf 8,2, und der größte Anstieg wurde für das selektiv neutrale Virulenzgen R9,4 (von 5 auf 31% der virulenten Klone) beobachtet (Smirnov, 86) ).
Eine Abnahme der Wachstumsrate einer Bevölkerung geht mit einer Abnahme der parasitären Aktivität der Bevölkerung einher. Daher sind in depressiven Jahren sowohl die Gesamtzahl der Rassen als auch der Anteil hochvirulenter Rassen geringer als in epiphytotischen (Borisenok, 1969). Wenn sich auf dem Höhepunkt der epiphytotischen Wetterbedingungen die für die Spätfäule ungünstigen Bedingungen ändern und der Kartoffelbefall abnimmt, nimmt auch die Konzentration hochvirulenter und aggressiver Klone ab (Rybakova et al., 1987).
Die Zunahme der Häufigkeit von Genen, die die Virulenz und Aggressivität der Population beeinflussen, kann auf die Auswahl virulenterer und aggressiverer Klone in der gemischten Population zurückzuführen sein. Um die Selektion zu demonstrieren, wurde eine Methode zur Analyse neutraler Mutationen entwickelt, die erfolgreich in Chemostatpopulationen von Hefen (Adams et al., 1985) und Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995) eingesetzt wurde.
Die Häufigkeit von Mutanten, die gegen Blasticidin S resistent sind, in der Feldpopulation von P. infestans nahm parallel zum Wachstum der Aggressivität der Population ab, was auf eine Veränderung der dominanten Klone während des Wachstums der Population hinweist (Rybakova et al., 1987).
Überwinterungsphase bei Knollen
Während der Überwinterung in Kartoffelknollen nehmen die Virulenz und Aggressivität der P. infestans-Stämme ab, und die Abnahme der Virulenz erfolgt langsamer als die Aggressivität (Rybakova und Dyakov, 1990). Offensichtlich sind unter Bedingungen, die zu einem raschen Anstieg der Populationsgröße (r-Selektion) führen, "zusätzliche" Virulenzgene und eine hohe Aggressivität nützlich, weshalb die Entwicklung von Epiphytotika mit der Selektion der virulentesten und aggressivsten Klone einhergeht. Unter Bedingungen der Sättigung der Umwelt, bei denen nicht die Reproduktionsrate, sondern die Persistenz der Existenz unter ungünstigen Bedingungen (K-Selektion) eine wichtige Rolle spielt, verringern "zusätzliche" Gene für Virulenz und Aggressivität die Fitness, und Klone mit diesen Genen sterben als erste aus, so dass die durchschnittliche Aggressivität und Die Virulenz der Bevölkerung nimmt ab.
Vegetationsphase im Boden
Diese Phase ist die mysteriöseste im Lebenszyklus (Andrivon, 1995). Seine Existenz wird rein spekulativ postuliert - aufgrund des Mangels an Informationen darüber, was mit dem Erreger über einen langen Zeitraum (manchmal mehr als einen Monat) passiert - vom Auftreten von Kartoffelsämlingen bis zum Auftreten der ersten Krankheitsherde auf ihnen. Auf der Grundlage von Beobachtungen und Experimenten wurde das Verhalten des Pilzes in dieser Lebensperiode rekonstruiert (Hirst und Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
An infizierten Knollen im Boden kann sich eine Sporulation des Pilzes bilden. Die entstehenden Sporen keimen mit Hyphen, die lange im Boden vegetieren können. Primäre (auf Knollen gebildete) und sekundäre (auf dem Myzel im Boden gebildete) Sporen steigen durch Kapillarströme zur Bodenoberfläche auf, erwerben jedoch die Fähigkeit, Kartoffeln erst zu infizieren, nachdem ihre unteren Blätter abfallen und mit der Bodenoberfläche in Kontakt kommen. Solche Blätter (nämlich die ersten Flecken der Krankheit sind auf ihnen zu finden) bilden sich nicht sofort, sondern nach längerem Wachstum und Entwicklung von Kartoffelspitzen.
Somit kann die saprotrophe Vegetationsphase auch im Lebenszyklus von P. infestans existieren. Wenn in der parasitären Phase des Lebenszyklus Aggressivität der wichtigste Bestandteil der Fitness ist, zielt die Auswahl in der saprotrophen Phase darauf ab, die parasitären Eigenschaften zu verringern, wie dies experimentell für einige phytopathogene Pilze gezeigt wurde (siehe Carson, 1993). Daher sollten in dieser Phase des Zyklus aggressive Eigenschaften am intensivsten verloren gehen. Bisher wurden jedoch keine direkten Experimente durchgeführt, um die obigen Annahmen zu bestätigen.
Saisonale Veränderungen beeinflussen nicht nur die pathogenen Eigenschaften von P. infestans, sondern auch die Resistenz gegen Fungizide, die in der polyzyklischen Phase (während Epiphytotien) wachsen und während der Winterlagerung abnehmen (Derevyagina et al., 1991; Kadish und Cohen, 1992). Ein besonders starker Abfall der Resistenz gegen Metalaxyl wurde zwischen dem Pflanzen der betroffenen Knollen und dem Auftreten der ersten Krankheitsherde auf dem Feld beobachtet.
Intraspezifische Spezialisierung und ihre Entwicklung
P. infestans verursacht Epidemien in zwei kommerziell wichtigen Kulturen, Kartoffeln und Tomaten. Epiphytotien auf Kartoffeln begannen kurz nachdem der Pilz neue Gebiete betreten hatte. Die Niederlage der Tomate wurde auch kurz nach dem Auftreten einer Infektion der Kartoffeln festgestellt, aber Epiphytotien der Tomate wurden erst hundert Jahre später - Mitte des XNUMX. Jahrhunderts - festgestellt. Hier schreiben Hallegli und Niederhauser über die Niederlage von Tomaten in den USA
(1962): „Etwa 100 Jahre nach der schweren Epiphytotie von 1845 wurden nur wenige oder fast keine Versuche unternommen, resistente Tomatensorten zu erhalten. Obwohl die Spätfäule bereits 1848 erstmals bei Tomaten registriert wurde, wurde sie erst nach einem starken Ausbruch der Krankheit im Jahr 1946 Gegenstand ernsthafter Aufmerksamkeit der Züchter dieser Pflanze. Auf dem Territorium Russlands wurde im 60. Jahrhundert die späte Tomatenfäule registriert. „Die Forscher haben dieser Krankheit lange Zeit keine Aufmerksamkeit geschenkt, da sie keinen nennenswerten wirtschaftlichen Schaden angerichtet hat. Aber in den 70ern und 1979ern. In der Sowjetunion werden Epiphytotien der Spätfäule auf Tomaten aus dem XNUMX. Jahrhundert beobachtet, hauptsächlich in der unteren Wolga-Region, in der Ukraine, im Nordkaukasus, in Moldawien ... “(Balashova, XNUMX).
Seitdem ist die Tomatenfäule durch die Spätfäule jährlich geworden, hat sich auf dem gesamten Gebiet des Industrie- und Eigenanbaus ausgebreitet und verursacht enorme wirtschaftliche Schäden an dieser Ernte. Was ist passiert? Warum trat das erste Auftreten des Parasiten auf Kartoffeln und die epiphytotische Läsion dieser Kultur fast gleichzeitig auf, und warum dauerte es ein Jahrhundert, bis das Epiphytotikum auf der Tomate auftrat? Diese Unterschiede stützen eher eine mexikanische als eine südamerikanische Infektionsquelle. Wenn sich die Art Phytophthora infestans als Parasit mexikanischer knollentragender Arten der Gattung Solanum gebildet hat, ist es verständlich, warum Kulturkartoffeln, die zur selben Gattung gehören wie die mexikanische Art, so stark betroffen waren, jedoch aufgrund des Fehlens einer Koevolution mit dem Parasiten, die keine Mechanismen spezifischer und unspezifischer Resistenz entwickelten.
Tomaten gehören zu einem anderen Teil der Gattung, die Art ihres Austauschs unterscheidet sich erheblich von Knollenarten. Trotz der Tatsache, dass die Tomate nicht außerhalb der Lebensmittelspezialisierung von P. infestans liegt, war die Intensität ihrer Schädigung für schwerwiegende wirtschaftliche Verluste unzureichend.
Das Auftreten von Epiphytotien bei einer Tomate ist auf schwerwiegende genetische Veränderungen des Parasiten zurückzuführen, die seine Fitness (Pathogenität) während des Parasitismus erhöhten. Wir glauben, dass die neue Form, die auf die Parasitierung der Tomate spezialisiert ist, die von M. Gallegly beschriebene T1-Rasse ist, die Kirschtomatensorten (Red Cherry, Ottawa) betrifft, die gegen die auf Kartoffeln weit verbreitete T0-Rasse resistent sind (Gallegly, 1952). Anscheinend eine Mutation (oder eine Reihe von Mutationen), die das T0-Rennen in das T1-Rennen verwandelte und zur Entstehung von Klonen führte, die in hohem Maße geeignet waren, Tomaten zu besiegen. Wie so oft ging eine Zunahme der Pathogenität für einen Wirt mit einer Abnahme für einen anderen einher, dh es entstand eine anfängliche, noch nicht vollständige intraspezifische Spezialisierung - für Kartoffeln (Rasse T0) und für Tomaten (Rasse T1).
Was ist der Beweis für diese Annahme?
- Vorkommen auf Kartoffeln und Tomaten. Bei Tomatenblättern überwiegt die T1-Rasse, bei Kartoffelblättern ist sie selten. Nach S.F.Bagirova und T.A. Oreshonkova (unveröffentlicht) in der Region Moskau in den Jahren 1991-1992 betrug das Auftreten der T1-Rasse bei Kartoffelpflanzungen 0% und bei Tomatenpflanzungen 100%; 1993-1995 - 33% bzw. 90%; im Jahr 2001 - 0% und 67%. Ähnliche Daten wurden in Israel erhalten (Cohen, 2002). Experimente mit der Infektion von Kartoffelknollen mit Isolaten der T1-Rasse und einer Mischung der Isolate T0 und T1 zeigten, dass Isolate der T1-Rasse in Knollen schlecht konserviert sind und durch Isolate der T0-Rasse ersetzt werden (Dyakov et al., 1975; Rybakova, 1988).
2) Dynamik der Rasse T1 in Tomatenpflanzungen. Die Primärinfektion von Tomatenblättern erfolgt durch Isolate der T0-Rasse, die bei der Analyse der Infektion an den ersten auf den Blättern gebildeten Stellen dominieren. Dies bestätigt das allgemein akzeptierte Schema der Parasitenmigration: Die Hauptinfektionsmasse von Kartoffeln besteht aus der T0-Rasse. Eine kleine Anzahl von T1-Klonen, die in Kartoffeln konserviert sind, verdrängen die T0-Rasse und reichern sich gegen Ende der epiphytotischen Periode an. Es ist auch möglich, dass es eine alternative Infektionsquelle für Tomatenblätter mit der T1-Rasse gibt, die nicht so stark wie Kartoffelknollen und -blätter ist, aber konstant. Daher hat diese Quelle einen schwachen Einfluss auf die genetische Struktur der Population, die Tomaten infiziert, bestimmt jedoch anschließend die Akkumulation der T1-Rasse (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994).
3) Aggressivität gegenüber Kartoffeln und Tomaten. Eine künstliche Infektion von Tomaten- und Kartoffelblättern mit Isolaten der Rassen T0 und T1 zeigte, dass erstere für Kartoffeln aggressiver sind als für Tomaten, und letztere für Tomaten aggressiver als für Kartoffeln. Diese Unterschiede manifestieren sich in der Verdrängung von Isolaten einer nicht „eigenen“ Rasse aus einer gemischten Population während Passagen auf Blättern in einem Gewächshaus (Dyakov et al., 1975) und in Feldparzellen (Leberton et al., 1999); Unterschiede in der minimalen Infektionslast, der Latenzzeit, der Größe der Infektionsherde und der Sporenproduktion (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994; Legard et al., 1995; Forbes et al., 1997; Oyarzun et al., 1998; Leberton et al. al., 1999; Vega-Sanchez et al., 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna et al., 2004).
Die Aggressivität von Isolaten der T1-Rasse gegenüber Tomatensorten ohne Resistenzgene ist so hoch, dass diese Isolate auf Blättern wie auf einem Nährmedium sporen, ohne das infizierte Gewebe zu nekrotisieren (Dyakov et al., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000).
4) Virulenz für Kartoffeln und Tomaten. Die T1-Rasse betrifft Kirschtomatensorten mit dem Ph1-Resistenzgen, während die T0-Rasse diese Sorten nicht infizieren kann, d.h. hat eine engere Virulenz. In Bezug auf Unterscheidungsmerkmale
Die R-Gene von Kartoffeln sind umgekehrt verwandt, d.h. Aus Tomatenblättern isolierte Stämme sind weniger virulent als "Kartoffel" -Stämme (Tabelle 11).
5) Neutrale Marker. Die Analyse neutraler Marker in den Populationen von P. infestans, die auf Kartoffeln und Tomaten parasitieren, zeugt auch von der multidirektionalen intraspezifischen Selektion. In den brasilianischen Populationen von P. infestans gehörten Tomatenblattisolate zur Klonlinie US-1 und solche aus Kartoffelblättern zur BR-1-Linie (Suassuna et al., 2004). In Florida (USA) dominierte seit 1994 der Klon US-90 auf Kartoffeln (mit einem Vorkommen von mehr als 8%) und die Klone US-11 und US-17 auf Tomaten, und die Isolate des letzteren sind aggressiver für Tomaten als für Kartoffeln (Weingartner) , Tombolato, 2004). Signifikante Unterschiede in den Genotypfrequenzen (DNA-Fingerabdrücken) in Kartoffel- und Tomatenisolaten wurden für 1200 P. infestans-Stämme festgestellt, die von 1989 bis 1995 in den Vereinigten Staaten gesammelt wurden (Deahl et al., 1995).
Mit der AFLP-Methode konnten 74-1996 1997 Stämme aus Kartoffel- und Tomatenblättern getrennt werden. in Frankreich und der Schweiz in 7 Gruppen. Die Kartoffel- und Tomatenstämme unterschieden sich nicht deutlich, aber die "Kartoffel" -Stämme waren genetisch vielfältiger als die "Tomaten" -Stämme. Ersteres wurde in allen sieben Clustern gefunden, letzteres nur in vier, was auf ein spezialisierteres Genom des letzteren hinweist (Knapova und Gisi, 2002).
6) Isolationsmechanismen. Wenn sich die Populationen des Parasiten auf zwei Wirtspflanzenarten dahingehend entwickeln, dass die Spezialisierung auf ihren „eigenen“ Wirt beschränkt wird, entstehen verschiedene prä- und postmeiotische Mechanismen, die den genetischen Austausch zwischen Populationen verhindern (Dyakov und Lekomtseva, 1984).
Mehrere Studien haben den Einfluss der Quelle von Elternstämmen auf die Effizienz der Hybridisierung untersucht. Bei der Kreuzung von Stämmen, die aus verschiedenen Arten der Gattung Solanum isoliert wurden, in Ecuador (Oliva et al., 2002) wurde festgestellt, dass Stämme mit dem Paarungstyp A2 aus wilden Nachtschatten (klonale Linie EC-2) die schlechtesten mit Stämmen aus Tomaten (Linie EC) kreuzten -3) und am effektivsten mit dem Kartoffelstamm (EC-1) gekreuzt.
Alle Hybriden erwiesen sich als nicht pathogen. Die Autoren glauben, dass der geringe Prozentsatz der Hybridisierung und die Verringerung der Pathogenität bei Hybriden auf postmeiotische Mechanismen der reproduktiven Isolierung von Populationen zurückzuführen sind.
In den Experimenten von Bagirova et al. (1998) wurde eine große Anzahl von Kartoffel- und Tomatenstämmen mit den Eigenschaften der T0- und T1-Rassen gekreuzt. Am fruchtbarsten waren Kreuzungen von aus Tomaten isolierten T1xT1-Stämmen (36 Oosporen im Sichtfeld des Mikroskops, 44% der Oosporenkeimung), am wenigsten wirksam waren Kreuzungen von T0xT1-Rassen, die aus verschiedenen Wirten isoliert wurden (eine geringe Anzahl sich entwickelnder und gekeimter Oosporen, ein hoher Anteil an abortiven und unterentwickelten Oosporen). ... Die Effizienz der Kreuzungen zwischen Isolaten der aus Kartoffeln isolierten T0-Rasse war mittelschwer. Da der Hauptteil der Stämme der T0-Rasse Kartoffeln betrifft, hat er eine zuverlässige Quelle für die Überwinterung - Kartoffelknollen, weshalb die Bedeutung von Oosporen als überwinternde infektiöse Einheiten für Kartoffelpopulationen gering ist. Die angepasste "Tomatenform" kann auf der Tomate in Form von Oosporen überwintern (siehe unten) und behält somit eine höhere Produktivität des Sexualprozesses bei. Aufgrund seiner hohen Fruchtbarkeit erwirbt T1 ein unabhängiges Potenzial für eine Primärinfektion bei Tomaten. Die von Knapova et al. (Knapova et al., 2002) erhaltenen Ergebnisse können auf die gleiche Weise interpretiert werden. Aus Kartoffeln isolierte Kreuzungen von Stämmen mit Tomatenstämmen ergaben die höchste Anzahl an Oosporen - 13,8 pro m². Medium (mit einer Ausbreitung von 5-19) und einem mittleren Prozentsatz der Keimung von Oosporen (6,3 mit einer Ausbreitung von 0-24). Kreuzungen von aus Tomaten isolierten Stämmen ergaben den niedrigsten Prozentsatz an Oosporen (7,6 mit einer Ausbreitung von 4 bis 12) mit dem höchsten Prozentsatz ihrer Keimung (10,8). Die Kreuzungen zwischen den aus Kartoffeln isolierten Stämmen ergaben eine mittlere Anzahl von Oosporen (8,6 mit einer hohen Datenstreuung - 0-30) und den niedrigsten Prozentsatz der Keimung von Oosporen (2,7). Daher sind Kartoffelstämme weniger fruchtbar als Tomatenstämme, aber Interpopulationskreuze ergaben keine schlechteren Ergebnisse als Intrapopulationskreuze. Es ist möglich, dass die Unterschiede zu den obigen Daten von Bagirova et al. Dies erklärt sich aus der Tatsache, dass russische Forscher mit Stämmen arbeiteten, die in den frühen 90er Jahren des 90. Jahrhunderts isoliert wurden, und Schweizer Forscher - mit Stämmen, die Ende der XNUMXer Jahre isoliert wurden.
Die Basis für eine geringe Fruchtbarkeit kann die Heteroploidie der Stämme sein. Wenn in mexikanischen Populationen, in denen der sexuelle Prozess und die Primärinfektion mit oosporösen Nachkommen regelmäßig sind, die meisten der untersuchten Stämme von P. Infestans diploid sind, wird in den Ländern der Alten Welt ein Intrapopulationspolymorphismus der Ploidie beobachtet (di-, tri- und tetraploide Stämme sowie heterokaryotische Stämme mit heteroploiden Kernen) und Stämme mit verschiedenen Arten der Paarung, d.h. gegenseitig fruchtbar, unterscheiden sich in der Kernploidie (Therrien et al., 1989, 1990; Whittaker et al., 1992; Ritch, Daggett, 1995). Die Vielfalt der Kerne bei Antheridien und Oogonien kann der Grund für eine geringe Fruchtbarkeit sein.
Der nukleare Austausch zwischen Hyphen während Anastomosen wird durch vegetative Inkompatibilität verhindert, die asexuelle Populationen in viele genetisch isolierte Klone aufspaltet (Poedinok und Dyakov, 1987; Gorbunova et al., 1989; Anikina et al., 1997b).
7) Konvergenz der Populationen. Die obigen Daten zeigen, dass eine Hybridisierung zwischen "Kartoffel" - und "Tomaten" P. infestans-Stämmen möglich ist. Eine gegenseitige Neuinfektion verschiedener Wirte ist ebenfalls möglich, wenn auch mit verringerter Aggressivität.
Eine Untersuchung von Populationsmarkern in Isolaten aus benachbarten Kartoffel- und Tomatenfeldern im Jahr 1993 zeigte, dass etwa ein Viertel der aus Tomatenblättern isolierten Isolate aus einem benachbarten Kartoffelfeld übertragen wurden (Dolgova et al., 1997). Theoretisch könnte angenommen werden, dass die Divergenz der Populationen auf zwei Wirten zunehmen und zur Entstehung spezialisierter intraspezifischer Formen (f.sp. Kartoffel und f.sp. Tomate) führen würde, insbesondere da Oosporen in Pflanzenresten persistieren können (Drenth et al., 1995) Bagirova, Dyakov, 1998) und Tomatensamen (Rubin et al., 2001). Folglich haben Tomaten derzeit eine Quelle der Frühlingsregeneration, unabhängig von Kartoffelknollen.
Es passierte jedoch alles anders. Durch die Überwinterung mit Oosporen konnte der Parasit das engste Stadium seines Lebenszyklus vermeiden - das monocyclische Stadium der Vegetation im Boden, in dem die parasitären Eigenschaften abnehmen, die im Sommer in der polyzyklischen Phase allmählich wiederhergestellt werden.
Tabelle 11. Häufigkeit von Virulenzgenen gegenüber Kartoffeldifferenzierungssorten in P. infestans-Stämmen
Land | Jahr | Durchschnittliche Anzahl von Virulenzgenen in Stämmen | Autor | |
aus Kartoffeln | aus Tomaten | |||
Frankreich | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton et al., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Frankreich, Schweiz | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002 |
Vereinigte Staaten | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin et al., 1995 |
USA, Zap. Washington | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance et al., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ecuador | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun et al., 1998 |
Israel | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Russland, Mosk. Region | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Russland, verschiedene Regionen | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaya und andere. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Primäre Zoosporangien und Zoosporen, die Oosporen keimen, weisen einen hohen Grad an parasitärer Aktivität auf, insbesondere wenn Oosporen parthenogenetisch unter dem Einfluss von Pheromonen eines Stammes mit der entgegengesetzten Art der Paarung gebildet wurden. Daher ist das infektiöse Material auf Tomatensämlingen, die aus mit Oosporen infizierten Samen gezogen wurden, sowohl für Tomaten als auch für Kartoffeln hoch pathogen.
Diese Veränderungen führten zur nächsten Umstrukturierung der Bevölkerung, die sich aus epidemiologischer Sicht in folgenden wichtigen Veränderungen äußerte:
- Infizierte Tomatensämlinge sind zu einer wichtigen Quelle für die Erstinfektion von Kartoffeln geworden (Filippov, Ivanyuk, persönliche Nachrichten).
- Epiphytotien auf Kartoffeln wurden bereits im Juni beobachtet, etwa einen Monat früher als gewöhnlich.
- Bei Kartoffelpflanzungen stieg der Prozentsatz der T1-Rasse an, der dort zuvor in unbedeutender Menge angetroffen wurde (Ulanova et al., 2003).
- Aus Tomatenblättern isolierte Stämme unterschieden sich nicht mehr von Kartoffelstämmen in der Virulenz auf Kartoffelunterscheidungsmerkmalen von Virulenzgenen und begannen, die Kartoffelstämme in ihrer Aggressivität nicht nur auf Tomaten, sondern auch auf Kartoffeln zu übertreffen (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al. , 2003).
Anstelle einer Divergenz gab es also eine Konvergenz der Populationen, die Entstehung einer einzelnen Population auf zwei Wirtspflanzen mit hoher Virulenz und Aggressivität für beide Arten.
Abschluss
Trotz mehr als 150 Jahren intensiver Untersuchung von P. infestans in der Biologie, einschließlich der Populationsbiologie dieses Erregers der wichtigsten Krankheiten kultivierter Solanaceen, ist vieles unbekannt. Es ist nicht klar, wie sich der Übergang einzelner Stadien des Lebenszyklus auf die Struktur der Populationen auswirkt, welche genetischen Mechanismen die kanalisierte Variabilität von Aggressivität und Virulenz aufweist, wie das Verhältnis der reproduktiven und klonalen Reproduktionssysteme in natürlichen Populationen ist, wie die vegetative Inkompatibilität vererbt wird, welche Rolle Kartoffeln und Tomaten bei der Primärinfektion dieser Kulturen spielen und in Wie wirken sie sich auf die Struktur der Parasitenpopulationen aus? Bisher wurden so wichtige praktische Probleme wie die genetischen Mechanismen zur Veränderung der Aggressivität des Parasiten oder die Erosion unspezifischer Kartoffelresistenzen nicht gelöst. Mit der Vertiefung und Ausweitung der Forschung zur Kartoffel-Spätfäule stellt der Parasit die Forscher vor neue Herausforderungen. Die Verbesserung der experimentellen Fähigkeiten und die Entstehung neuer methodischer Ansätze zur Manipulation mit Genen und Proteinen lassen jedoch auf eine erfolgreiche Lösung der gestellten Fragen hoffen.
Der Artikel wurde in der Zeitschrift "Potato Protection" (Nr. 3, 2017) veröffentlicht.